Allevamento di P unipuncta

La colonia di P. unipuncta è stata avviata a partire da individui adulti catturati con trappole luminose nei campi sperimentali dell’Università di Lleida.

L’allevamento è stato mantenuto in cella climatizzata a 25º ± 1º C, UR = 70%, fotoperiodo 16 L : 8 D.

Gli adulti sono stati collocati in gabbie di plexiglass si dimensioni 60x50x60 cm, con prese d’aria in garza, e sono stati nutriti con una soluzione di acqua e saccarosio al 5%, posta in abbeveratoi in plastica di forma cilindrica (h. 3 cm, Ø 5 cm) con un foro sul tappo in cui era stato collocato un batuffolo di cotone. Come substrato di ovideposizione sono state inoltre poste 2-3 piante di mais all’interno della gabbia, di altezza pari a 40-50 cm. Tali piante venivano coltivate nella serra sperimentale dell’IRTA.

Le larve neosgusciate venivano prelevate dalla gabbia degli adulti con un pennello e, per evitare cannibalismo, venivano poste una ad una in cilindri di dimensioni h. 3 cm x Ø 5 cm, contenti un cubetto di 1x1x1 cm di dieta artificiale. La dieta veniva fornita alle larve ogni 2 giorni.

Una volta raggiunta la maturità, le larve si incrisalidavano nei cilindri e da qui venivano prelevate e spostate nella gabbia degli adulti in attesa dello sfarfallamento.

La dieta era basata su quella per nottuidi messa a punto da Shorey & Hale (1965), e conteneva:

- 600 ml acqua

- 12 g agar

- 100 g fagioli cannellini secchi

- 30 g lievito di birra

- 3 g acido ascorbico

- 1 g acido sorbico

- 2 g Methil-4-hidroxibenzoato

- 2 ml formaldeide

Prima di procedere alla preparazione della dieta, i fagioli venivano posti in acqua per 24 ore circa, dopodiché venivano triturati con un mixer elettrico.

Per la preparazione della dieta veniva portata ad ebollizione l’acqua con l’agar e la sospensione così composta veniva fatta bollire per 10 minuti circa. Quando la temperatura della sospensione scendeva a 60º C circa, potevano essere aggiunti gli altri ingredienti, con l’ordine in cui sono stati elencati. Gli ingredienti venivano mescolati con un mixer elettrico, fino ad ottenere un composto omogeneo e senza grumi. La dieta a questo punto veniva versata in scatole Petri in vetro (25 cm Ø) formando un strato alto circa 1 cm e una volta raffreddata era conservata in frigorifero a 4-5°C.

3.6.2 Impostazione delle prove

E’ stata effettuata una prova finalizzata a verificare l’accettabilità e l’idoneità di P. unipuncta da parte di E. larvarum.

Per la prova sono state isolate dall’ allevamento 40 larve di IV o V età di P. unipuncta, che erano state nutrite con dieta artificiale e 40 larve di IV o V età che erano state nutrite con foglie di mais. Tutte le larve sono state poste all’interno di una gabbia di allevamento contenente circa 30-35 coppie di E. larvarum, sfarfallate da 5-7 giorni e sono state esposte alle femmine fino alla deposizione di un numero variabile di uova da 4 a 6 / larva (Dindo et al. 1999). Dopo la deposizione, ciascuna larva veniva rimossa dalla gabbia di E. larvarum e rimessa nel suo cilindro. I cilindri venivano mantenuti in cella climatizzata a 25º±1°C, con umidità relativa 65 ± 5% e fotoperiodo 16 L : 8 D. Ogni giorno veniva effettuato il controllo delle larve che erano state esposte al parassitoide, per verificare eventuale morte, muta, incrisalidamento o presenza di pupari e veniva fornito alimento fresco. Altre 40 larve di IV o V età sono state isolate, nutrite sia con dieta che con foglie di mais e mantenute alle stesse condizioni climatiche, come testimone di controllo.

3.6.3 Rilievo dei dati e analisi statistica

Il rilievo dei dati è stato finalizzato al calcolo dei seguenti parametri:

1. Numero di individui morti prima di arrivare allo stato adulto, con relativa percentuale di mortalità (= n. individui morti/n. iniziale larve x 100 e numero di adulti sfarfallati, con relativa percentuale di sfarfallamento (= n. adulti sfarfallati/n. iniziale larve x 100)

2. Numero delle larve parassitizzate con successo ( cioè che hanno prodotto

pupari) e relativa percentuale (=n. larve che hanno prodotto pupari/n. complessivo larve morte x 100)

3. Numero pupari sfarfallati. Dato l’esiguo numero, non è stata calcolata la percentuale.

Per i parametri indicati ai punti 1. e 2., l’analisi statistica è stata effettuata mediante tabelle di contingenza 2x2 utilizzando il programma STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., 2001). E’ stata applicata la correzione di Yates per piccoli campioni (< 100).

3.7 Risultati

Indipendentemente dal tipo di alimento, le larve di P. unipuncta su cui E.larvarum aveva ovideposto sono morte in modo significativamente maggiore rispetto alle larve testimoni, non esposte al parassitoide (Tabella 3.2) La mortalità delle larve esposte al parassitoide non è stata influenzata in modo significativo dall’alimentazione delle larve (Tabella 3.3). La percentuale di larve morte che hanno prodotto pupari è stata bassa, sia nelle larve alimentate con la pianta, sia in quelle alimentate con la dieta, senza significative differenze fra i due tipi di alimentazione, anche se la percentuale riferita alle larve alimentate su dieta è stata leggermente più alta (Tabella 3.4). E’ da segnalare che non è mai stato ottenuto più di un pupario per larva. I pupari ottenuti nelle larve alimentate su dieta hanno lasciato sfarfallare l’adulto in 5 casi su 7. Dai 2 pupari ottenuti da larve ottenute su pianta non è sfarfallata E. larvarum.

Pseudaletia unipuncta

Morti (=individui in cui si sono formati pupari +individui morti per altre

cause) Vivi (= adulti sfarfallati) χ² P N. % N. % Testimone (larve su dieta e pianta, non esposte a E. larvarum)

2 5% 38 95%

Larve su dieta, esposte

a E. larvarum 30 75% 10 25%

37,97 P <0,001

N. % N. %

Testimone (larve su dieta e pianta, non esposte a E. larvarum)

2 5% 38 95%

Larve su pianta,

esposte a E. larvarum 32 80% 8 20%

43,02 P<0,001

Tabella 3.2 - Tabelle di contingenza 2x2 per valutare l’indipendenza dell’esposizione a femmine di E. larvarum e della mortalità di larve di P. unipuncta (alimentate con dieta artificiale o con mais). E’ stata applicata la correzione di Yates per piccoli campioni (<100)

Table 3.2 - The 2x2 contingency tables for testing the independence of exposure to E. larvarum females and the mortality of P. unipuncta larvae (fed artificial diet or maize plant). Yates corrected chi-square values are presented (sample size < 100)

Alimentazione delle larve di Pseudaletia unipuncta

esposte a E. larvarum

Morti (=individui in cui si sono formati pupari

+individui morti per altre cause) Vivi (= adulti sfarfallati) χ² P N. % N. % Pianta di mais 32 80% 8 20% Dieta artificiale 30 75% 10 25% 0,07 P >0,05

Tabella 3.3 - Tabella di contingenza 2x2 per valutare l’indipendenza del tipo di alimentazione e della mortalità di larve di P. unipuncta in seguito a parassitizzazione da parte di Exorista larvarum. E’ stata applicata la correzione di Yates per piccoli campioni (<100)

Table 3.3 - The 2x2 contingency table for testing the independence of larval food and larval mortality of P. unipuncta following parasitization by E. larvarum . Yates corrected chi-square value is presented (sample size < 100)

Alimentazione delle larve di Pseudaletia unipuncta esposte a E. Larvarum

Larve morte che hanno prodotto

pupari

Larve morte che non hanno prodotto pupari χ² P N. % N. % Pianta di mais 2 6,3% 30 93,7% Dieta artificiale 7 23,3% 23 76,7% 1,67 P> 0,05

Tabella 3.4 - Tabella di contingenza 2x2 per valutare l’indipendenza del tipo di alimentazione e del numero di larve morte di P. unipuncta che hanno prodotto un

pupario, in seguito a parassitizzazione da parte di Exorista larvarum. E’ stata applicata la correzione di Yates per piccoli campioni (<100).

Table 3.4 - The 2x2 contingency table for testing the independence of larval food and number of dead larvae which produced a puparium following parasitization by E. larvarum. Yates corrected chi-square values are presented (sample size < 100). No larva produced more than one puparium

3.8 Discussione dei risultati e conclusioni

Nella prova effettuata, E. larvarum ha dimostrato una scarsa efficacia quale agente di controllo di S. littoralis, pure annoverata tra i suoi ospiti naturali (Hafez, 1953 a,b,c; Hafez et al., 1976; Assal e Koilab, 1984). In base al tempo impiegato dalle femmine del tachinide per ovideporre, l’accettabilità di S. littoralis non è stata significativamente dissimile rispetto a quella di G. mellonella, abitualmente impiegata come ospite di sostituzione per questo parassitoide nei laboratori del DiSTA.. Va però notato che, per deporre un numero di 4-5 uova su ogni larva, le femmine hanno impiegato in media 1 minuto abbondante in più su S. littoralis piuttosto che su G. mellonella, ma soprattutto, pur accettato, il nottuide si è, in questa prova, dimostrato inidoneo per il parassitoide: infatti, su 80 larve su cui le femmine avevano ovideposto, una sola ha prodotto un pupario. Questa situazione ricalca, in modo più accentuato, quella osservata da Dindo et al. (1999) in uno studio di laboratorio in cui era stato valutato il parassitismo di E. larvarum nell’ospite naturale Lymantria dispar e in G. mellonella. Le larve parassitizzate con successo (cioè che produssero pupari) furono il 23% per L. dispar e l’87% per G. mellonella. Un’ipotesi per la minore idoneità degli ospiti naturali rispetto a quelli di sostituzione è stata formulata da Pimentel (1963) e da Hokkanen e Pimentel (1984), dopo avere messo a confronto un certo numero di nuove e vecchie associazioni ospite-parassitoide (il sistema G.mellonella-E.larvarum rappresenta una nuova associazione, i sistemi L.dispar-E. larvarum e S. littoralis-E. larvarum rappresentano vecchie associazioni). In base a questa ipotesi, nelle vecchie associazioni si sarebbe creata nel tempo, una sorta di equilibrio tra

parassitoide e ospite, quest’ultimo cioè avrebbe sviluppato, nei confronti dell’antagonista, una sorta di resistenza; viceversa, nelle nuove associazioni, questo equilibrio non si sarebbe ancora evoluto. Hokkanen (1983) ha condotto uno studio sull’evoluzione avvenuta nell’America tropicale, nell’arco di 200 anni di interazione tra l’ospite Nezara viridula (L.) e il parassitoide tachinide Trichopoda pennipes (Fabricius); l’autore è giunto alla conclusione che quest’ospite ha evoluto una capacità di resistere agli attacchi del parassitoide superiore del 10% rispetto a ospiti conspecifici, ma provenienti da altre regioni geografiche.

Naturalmente, allo stato attuale, per la coppia S. littoralis-E. larvarum (così come per L. dispar-E. larvarum) non può essere esclusa nemmeno un’ipotesi diversa, e per certi versi, opposta: cioè che E. larvarum, allevata per anni a spese di un ospite di sostituzione, possa avere perso (o diminuito) la propria capacità di parassitizzare con successo ospiti naturali (la colonia presso il DiSTA è stata allestita nel 1992 e rinnovata nel 2004 con parassitoidi sfarfallati da larve parassitizzare di L. dispar raccolte in campo). Questo è, del resto, uno dei problemi che devono essere costantemente affrontati quando si allevano massalmente insetti entomofagi, anche a scopi commerciali (Van Lenteren, 2003). Per quanto riguarda S. littoralis, comunque, i risultati ottenuti sembrano indicare che l’azione limitatrice di E. larvarum nei confronti nel nottuide sia scarsamente efficace. Maggiori ricerche sono comunque necessarie prima di trarre conclusioni definitive. In particolare, sarà necessario stabilire se effettivamente la mortalità riscontrata in S. littoralis possa essere ricondotta a un’azione del parassitoide (in particolare al suo sviluppo, quantunque incompleto). A tale fine, occorrerà dissezionare larve di S. littoralis, parassitizzate senza avere prodotto pupari di E. larvarum e comunque morte, per rilevare eventuali tracce di larve del tachinide. Inoltre sarà opportuno verificare se, a seguito della parassitizzazione da parte di E. larvarum, l’entomofago, pur non completando il proprio sviluppo, possa indebolire l’ospite prima di ucciderlo, contribuendo quindi a limitare l’attività trofica del fitofago, come del resto riscontrato in altri sistemi ospite-parassitoide ad antagonista tachinide (Dindo, 1983). Va tuttavia rilevato che E. larvarum, essendo un parassitoide a sviluppo indipendente dalla fisiologia dell’ospite e a fase parassitaria breve, presenta con

l’ospite stesso relazioni assai poco sofisticate (Mellini, 1986): è quindi probabile che il comportamento della vittima, prima di soccombere, venga scarsamente influenzato dall’azione del tachinide.

Per quanto concerne P. unipuncta, essa non è segnalata come ospite naturale di E. larvarum. Tuttavia Arnaud (1978) cita questo nottuide come ospite naturale di un tachinide neartico, Exorista mella Walker. Tale specie, secondo Sabrosky e Reardon (1976) e Morewood e Wood (2002), è assai simile a E. larvarum; secondo i medesimi autori esisterebbero degli individui intermedi (ibridi?) tra le due specie, o comunque individui che non possono essere attribuiti con certezza all’una o all’altra specie. Nel presente studio, P. unipuncta si è dimostrata scarsamente idonea per lo sviluppo di E. larvarum, indipendentemente dalla dieta somministrata alle larve (dieta artificiale o pianta di mais). Da segnalare, a questo proposito, che vari studi hanno posto in luce che l’alimentazione dell’ospite può, in misura maggiore o minore, avere un effetto sul parassitoide (Elzen et al., 1984; Reis et al., 2003). Non mancano, comunque, in letteratura, casi in cui, come nel presente studio, l’alimentazione dell’ospite è ininfluente ai fini dello sviluppo del parassitoide (Urrutia et al., 2007). Va comunque enfatizzato che, nelle larve su cui le femmine di E. larvarum avevano ovideposto, la mortalità è stata sensibilmente più alta rispetto alle larve testimoni (non parassitizzate) anche se pochi parassitoidi hanno completato con successo il loro sviluppo. Questa situazione conferma quanto era già stato osservato, in uno studio precedente, da Simoes et al.(2004) in larve della stessa P. unipuncta e di altri due nottuidi, nonché da Dindo et al. (1999; 2002) in L. dispar: un’elevata mortalità delle larve ospiti sottoposte a parassitizzazione nonostante le rese in pupari fossero basse. Va notato che, nello studio condotto da Simoes et al., 2004, per nessuno dei tre nottuidi oggetto di studio, compresa P. unipuncta, era stato effettuato un confronto con larve testimoni non parassitizzate; tale confronto è stato invece condotto nella presente ricerca. I risultati qui ottenuti portano ad avvalorare l’ipotesi già avanzata nello studio di Simoes (2004): cioè che l’elevata mortalità di larve sottoposte a parassitizzazione sia correlata con l’attività del parassitoide, anche quando questo non riesce a completare il suo sviluppo. In conclusione, lanci inondativi di E. larvarum contro

P. unipuncta potrebbero efficacemente contribuire ad abbassarne la popolazione, anche se la parassitizzazione viene portata a termine con successo in pochissimi casi. L’efficacia di un parassitoide in campo viene di solito valutata in base al numero di insetti bersaglio parassitizzati con successo (Grenier e De Clercq, 2003), ma, come già enfatizzato, tra gli altri, da Dindo (1986), si dovrebbe tenere conto anche di altri fattori di mortalità dell’ospite correlati all’attività del parassitoide, come le punture dell’ospite e l’ “host feeding” per gli imenotteri e la mortalità dovuta a sviluppo incompleto del parassitoide tanto per gli imenotteri che per i tachinidi.

CAPITOLO 4

4.1 Ruolo svolto dalla pianta nel processo di parassitizzazione di Lepidotteri