Altri agenti che inducono la fosforilazione di H2A

La fosforilazione di H2AX non è indotta solo dall’esposizione a radiazioni ionizzanti. Alcuni studi hanno evidenziato la comparsa dei foci γ-H2AX in cellule trattate con diversi fattori di stress (Zouh et al. 2006); γ-H2AX è stato usato come indicatore di morte cellulare indotta da agenti chemoterapeutici (Banath and Olive, 2003); come marker di DSBs in cellule di adenocarcinoma polmonare umano esposte a fumo di tabacco (Albino et al. 2004); come strumento per valutare l’efficacia di terapie antitumorali e per la diagnosi di campioni bioptici di neoplasie (Wasco and Pu, 2008); l’induzione di foci γ-H2AX è stata osservata in risposta a concentrazioni crescenti di agenti genotossici a diverso meccanismo d’azione quali l’etoposide (inattivatore dell’enzima topoisomerasi II), la bleomicina (agente capace di produrre direttamente rotture della doppia elica) e il metil-metansulfonato (MMS, agente alchilante) (Cowell et al. 2007).

A seconda dell’agente genotossico utilizzato sono state notate differenze nella distribuzione e nella morfologia dei foci: foci indotti da etoposide apparivano più diffusi rispetto a quelli indotti da bleomicina; i foci indotti da bleomicina si presentavano più brillanti e più distinti rispetto a quelli indotti da etoposide; i foci indotti da MMS mostravano generalmente un segnale più debole e difficilmente distinguibile rispetto agli altri precedentemente descritti. I foci indotti da tali sostanze erano localizzati preferenzialmente nelle regioni eucromatiche della maggior parte dei nuclei delle cellule analizzate, un fenomeno riscontrato anche in cellule esposte a irraggiamento (Cowell et al., 2007).

γ-H2AX è stato utilizzato come marker di danno genotossico in molti studi che

prevedevano il trattamento dei campioni con sostanze mutagene quali idrocarburi policiclici aromatici (Mattsson et al. 2009), DNA crosslinkers (Clingen et al. 2008), radiazioni ionizzanti (MacPhail et al. 2003), radiazioni ultraviolette (Tanaka et al. 2007), farmaci antitumorali (Ishiguro et al. 2006). E’ risultato che i raggi UV innescano la fosforilazione di H2AX nei fibroblasti umani (Rogakou et al. 1998; Zhou and Elledge, 2000; Fernandez-Capetillo et al. 2002; Iliakis et al. 2004) ed in alcune linee cellulari umane di cancro (Rogakou et al. 1999; Iliakis et al. 2003). Sebbene i raggi UV non inducono direttamente DSB nel DNA, è stato

essere causate dalla forca replicativa o dalla riparazione degli addotti al DNA (Paulsen and Cimprich, 2007). Quindi la fosforilazione di H2AX mediata da ATR non necessariamente indica la presenza di una DSB nel genoma. Questo è da tenere in considerazione quando γ- H2AX è usato come un indicatore delle DSBs, in particolare nelle cellule in fase S, e può in parte spiegare l’alto numero di γ-H2AX normalmente visti in fase S in assenza di trattamenti che inducono danni al DNA.

Uno specifico campo di ricerca interessa l’induzione della fosforilazione di H2AX in seguito ad esposizione ad agenti che producono legami crociati inter elica (interstrand cross link, ICL). E’ stato osservato che γ-H2AX si associa con molti fattori di ricombinazione omologa richiesti per la riparazione degli ICLs. Sulla base di queste osservazioni è stato proposto che γ-H2AX possa essere utilizzato come biomarcatore di risposta cellulare, e relativa efficacia terapeutica, a trattamenti antitumorali con farmaci induttori di ICL. La fosforilazione di H2AX in risposta ad agenti che inducono ICLs si pensa sia correlata alla presenza di DSBs associate alla riparazione di questo tipo di danno al DNA o all’interruzione delle forche replicative che incontrino ICL durante la fase S (Clingen et al. 2008; Olive and Banath, 2009).

5.6

La fosforilazione di H2AX durante il ciclo cellulare

Poiché le modificazioni post-traduzionali indotte nelle molecole H2AX dall’irraggiamento, che portano alla formazione di foci microscopicamente visibili, implicano la fosforilazione/defosforilazione di migliaia di molecole in un volume corrispondente circa ad 1 Mb è possibile che le variazioni dello stato di condensazione della cromatina che avvengono normalmente durante le varie fasi del ciclo cellulare influenzino la formazione dei foci γ-H2AX.

La cinetica di comparsa e scomparsa dei foci γ-H2AX è stata confrontata con la cinetica di induzione e riparazione di DSBs in cellule mitotiche e in fase G1 dopo irraggiamento. Mentre non sono state osservate differenze tra i due stadi del ciclo cellulare per quanto riguarda la cinetica delle DSBs, invece la scomparsa dei foci γ-H2AX è risultata più lenta nelle cellule mitotiche rispetto a quelle in G1. Tale effetto potrebbe essere ricondotto all’alto grado di compattazione delle proteine istoniche attorno alle DSBs nei cromosomi mitotici: ciò limiterebbe l’accessibilità degli enzimi coinvolti nella defosforilazione di γ- H2AX nei cromosomi metafasici rispetto ai cromosomi in interfase G1. Un’altra possibile spiegazione potrebbe essere quella secondo cui i foci γ-H2AX persistano “intrappolati” nella

cromatina ricompattata. Questa è un’evidenza del fatto che DSBs e foci γ-H2AX non risultano direttamente correlati in cellule mitotiche (Kato et al. 2007).

La fosforilazione di H2AX è stata anche implicata, insieme all’azione dell’enzima BRCA1, nella replicazione tardiva del cromosoma X inattivo (Xi) delle cellule femminili di mammifero. A tale riguardo è stato ipotizzato che la fosforilazione di H2AX possa contribuire dopo la replicazione, in sinergia con l’azione dei complessi di rimodellamento della cromatina, al ripristino delle modificazioni istoniche tipiche dei nucleosomi di Xi (Chadwick and Lane, 2005).

5.7

γ-H2AX e l’apoptosi

La morte cellulare programmata (Programmed Cell Death, PCD) o apoptosi è un processo fisiologico, che si verifica negli organismi multicellulari, mediante il quale vengono eliminate delle cellule durante lo sviluppo embrionale e nell’adulto. L’apoptosi svolge un ruolo molto importante nel contrastare la crescita tumorale e difetti nei pathways di segnalazione apoptotici sono stati riscontrati in cellule tumorali (Hanahan and Weinberg, 2000). Durante la PCD viene attivata una specifica famiglia di cisteina proteasi, le caspasi, i cui componenti sono in grado di attuare proteolisi di molte molecole e condurre quindi alla distruzione della cellula apoptotica. I cambiamenti morfologici attivati dalle caspasi includono la contrazione della cellula, la condensazione cromatinica, la frammentazione del DNA e, l’eventuale disintegrazione della cellula in piccoli frammenti che possono essere fagocitati dalle cellule circostanti. Esistono due principali pathways apoptotici che portano allo stesso effetto finale, l’attivazione delle caspasi: il pathway estrinseco o dei recettori di morte (Ashkenazi and Dixit, 1998) e il pathway intrinseco o mitocondriale (Green and Reed, 1998) (Figura 26).

Figura 26: Cambiamenti morfologici in una cellula correlati alla morte cellulare programmata

E’ stato osservato che H2AX viene fosforilato anche durante l’apoptosi, in concomitanza con l’inizio della frammentazione del DNA (Rogakou et al. 2000). Nel lavoro di Mukherjee e collaboratori (Mukherjee et al. 2006) è stato dimostrato, in cellule ovariche di Hamster cinese e in fibroblasti umani, che la fosforilazione di H2AX coincide con la frammentazione del DNA ed è limitata a nuclei che presentano una caratteristica condensazione della cromatina. In tale lavoro è stato dimostrato che la chinasi responsabile della fosforilazione di H2AX associata all’apoptosi sarebbe la DNA-PK. Cosa potrebbe indicare la fosforilazione di H2AX in uno stadio tardivo dell’apoptosi quale la frammentazione del DNA? A tale proposito sono state avanzate due ipotesi. Secondo la prima la fosforilazione di H2AX potrebbe non essere semplicemente un riflesso condizionato associato alla frammentazione del DNA, ma potrebbe rappresentare l’innesco di un estremo tentativo di riparazione tramite NHEJ mediato dalla DNA-PK, che potrebbe, seppure con bassa probabilità e al prezzo della formazione di riarrangiamenti cromosomici, revertire il processo apoptotico (Betti et al. 2001).

La seconda ipotesi riguardante il significato della fosforilazione di γ-H2AX nei processi apoptotici metterebbe in relazione il fenomeno alle modificazioni conformazionali della cromatina che si verificano in concomitanza con la frammentazione della doppia elica e che sono probabilmente propedeutiche alle fasi successive di fissione nucleare e fagocitosi.