SCOPO DELLA RICERCA

Le cellule eucariotiche rispondono ad agenti esogeni ed endogeni attivando varie pathways di trasduzione del segnale che portano all’arresto del ciclo cellulare, alla riparazione del danno al DNA o all’innesco della morte per apoptosi. La presenza di cellule danneggiate, infatti, determina risposte cellulari assai complesse e articolate; la scelta del destino di ogni cellula dipende dal tipo cellulare, dall’estensione del danno e dall’ambiente extracellulare. Per esempio l’apoptosi può essere la risposta preferita da cellule danneggiate in cui è fallito il meccanismo riparativo. Queste cellule infatti, se non eliminate, costituiscono un rischio di accumulo di aberrazioni cromosomiche che sono l’origine della cancerogenesi. Le rotture a doppia elica del DNA (DSBs) costituiscono la lesione critica che, se non riparata o erroneamente riparata, può causare le aberrazioni cromosomiche, la morte cellulare come anche mutazioni e trasformazione cellulare. I meccanismi in grado di eliminare le DSB si suddividono in processi dipendenti dall’omologia di sequenza (Homologous Recombination) ed indipendenti da essa (Non Homologous End Joining). Molti passaggi di questi delicati meccanismi e le relazioni che intercorrono tra di essi non sono ancora ben compresi. La scoperta di nuove pathways cellulari è spesso favorita dallo studio delle malattie genetiche, come l’Atassia Telangiectasia, nelle quali le stesse pathways risultano difettive. Alternativamente, è possibile l’analisi delle proteine coinvolte nella riparazione che interagiscono con le proteine della cromatina, come l’istone H2AX.

Durante il primo anno di dottorato al fine di comprendere meglio le pathways cellulari legate alla riparazione del danno al DNA, il nostro studio si è rivolto ad una malattia genetica, l’Atassia Telangiectasia. Questa sindrome genetica autosomica recessiva sfocia in un intricato fenotipo cellulare e si manifesta in difetti a quasi tutti i tessuti dell’organismo. Tutte le disfunzioni sono derivanti dall’inattivazione di un singolo gene, il gene ATM (Ataxia

Telangiectasia Mutated). Si è arrivati all’identificazione di questo gene nel 1988 quando Gatti e collaboratori (1988) lo mapparono sul cromosoma 11q22-23. Numerose ricerche seguite a

mutazione nel gene p53. Questo gene codifica per una proteina di 393 residui aminoacidici e

53 kda. Essa è in grado di legarsi come tetramero ad una sequenza specifica del DNA comportandosi così da attivatore trascrizionale di numerosi geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, nella riparazione del DNA e nel processo apoptotico. Il compito di p53 consiste nel bloccare la divisione cellulare per impedire che il DNA danneggiato si duplichi, dando così alle cellule la possibilità di correggere l’errore prima che questo passi alle cellule figlie; non meno importante è il ruolo della p53 nell’innesco della morte per apoptosi in caso di danno eccessivo o irreparabile. È stato dimostrato che nel nucleo esistono varie fosfoforme (famiglie) di p53, che differiscono tra loro per l’amminoacido modificato al momento dell’attivazione. È stato ipotizzato un ruolo diverso per ogni fosfoforma di p53 nei vari processi del ciclo cellulare: per esempio la p53ser15 sembra avere un ruolo attivo nel processo di riparazione del DNA poiché colocalizza con proteine che intervengono in questo processo (Al Rashid et al. 2005). L’attivazione di tutte le fosfoforme è sotto il controllo di ATM.

In questo contesto si inserisce la nostra ricerca con il fine di saggiare il ruolo di p53 in cellule AT in seguito ad esposizione a radiazione ionizzante. A questo scopo abbiamo utilizzato la PFT-α, un inibitore sintetico della p53 che sembra interferire con l’attività trascrizionale della proteina. Allo scopo di chiarire il ruolo di p53 nella riparazione delle DSBs indotte dalla radiazione ionizzante abbiamo analizzato l’espressione sia di p53 e p53ser15 sia di proteine implicate nel processo di riparazione del DNA come RAD51 tramite western blotting (con e senza PFT-α). Una volta comprese le basi molecolari del difetto che conduce all’Atassia Telangiectasia si potrebbero ottenere importanti implicazioni terapeutiche.

Nel secondo anno di tesi lo studio si è indirizzato a determinare la relazione tra la frequenza di alterazioni cromosomiche e l’apoptosi e ad esaminare il ruolo di p53 nel controllo della stabilità genomica in linee cellulari umane quali i linfociti e i fibroblasti primari, dopo esposizione a radiazione ionizzante in diverse fasi del ciclo cellulare. Tale studio si inserisce in un contesto più ampio in cui secondo studi precedenti (Schwartz e Jordan, 1997) l’apoptosi elimina selettivamente le cellule che portano aberrazioni instabili (dicentrici e ring) rispetto a quelle con aberrazioni stabili (traslocazioni bilanciate); inoltre, nei linfociti umani irradiati in G0 e o immediatamente stimolati a proliferare o mantenuti per 48h nella fase G0, la diminuzione della frequenza di aberrazioni instabili è correlata con l’apoptosi-p53-dipendente (Bassi et al. 2003; Belloni et al. 2005); infine, in un recente lavoro (Belloni et al. 2008) è stata fornita un’evidenza diretta del fatto che le cellule contenenti cromosomi dicentrici sono di preferenza eliminate mediante morte apoptotica.

Per quanto riguarda i fibroblasti umani primari è stato condotto uno studio allo scopo di analizzare la correlazione tra le aberrazioni cromosomiche e la morte cellulare indotte dalle radiazioni. I fibroblasti, infatti, costituiscono una linea cellulare di interesse radiobiologico e clinico nel momento in cui si considerano le implicazioni del danno genetico in ambito radioterapico oltre che in quello della normale esposizione ambientale. Il sistema cellulare dei fibroblasti, da noi scelto per tale lavoro, fornisce la possibilità di comparare i risultati ottenuti con quelli già descritti nel sistema linfocitario poiché sono cellule umane normali, non immortalizzate, e si può sfruttare la confluenza, in cui la crescita si arresta per il fenomeno di inibizione da contatto, per mimare la fase G0 del ciclo cellulare. Sperimentalmente, colture confluenti di fibroblasti sono state irradiate e immediatamente dopo sono state indotte alla proliferazione mediante tripsinizzazione e nuova semina. A vari tempi di recupero dopo l’irradiazione è stata effettuata l’analisi del danno citogenetico, dell’apoptosi e l’andamento del ciclo cellulare.

Infine, il terzo anno di dottorato è stato dedicato allo studio delle proteine coinvolte nella riparazione che interagiscono con le proteine della cromatina, come ad esempio l’istone H2AX. Successivamente all’interazione proteine-istone si ha un rimodellamento della cromatina che permette l’accesso al sito danneggiato e la riparazione della lesione in maniera regolata nel tempo. Negli eucarioti, la riparazione è regolata da complessi multiproteici che sono organizzati in foci nel sito della lesione. Questi foci sono strutture di giga-dalton altamente dinamiche in grado di riparare contemporaneamente lesioni multiple del DNA. Inoltre, la composizione di questi centri di riparazione dipende dal tipo di lesione al DNA ed è in stretta relazione con la fase del ciclo cellulare. Molti dei componenti dei foci di riparazione sono regolati tramite modificazioni post-traduzionali, quali la fosforilazione e l’ubiquitinazione.

L’istone H2AX fosforilato (γ-H2AX) è essenziale per un efficiente riconoscimento e riparazione delle DSBs, e molte molecole, spesso migliaia, di H2AX vengono rapidamente fosforilate ad ogni sito in cui è presente una DSB (Rogakou et al. 1998). Il sito di fosforilazione è una serina situata a 4 residui dal C-terminale che è evolutivamente conservata negli organismi. L’istone H2AX può essere fosforilato da tre diversi tipi di chinasi: ATM,

l’analisi dei foci dell’γ-H2AX ha un ruolo chiave nello studio della relazione tra lesione primaria al DNA, riparazione e formazione di danno cromosomico.

Il nostro studio si è incentrato sull’analisi dell’induzione dell’istone γ-H2AX fosforilato da parte di diversi agenti sia chimici che fisici che differiscono per il tipo di danno indotto al DNA, allo scopo di mettere in relazione il tipo di danno indotto dai diversi agenti, la sua segnalazione e la sua conseguente riparazione con il fine di determinare il coinvolgimento dell’istone H2AX nelle varie fasi che portano alla risoluzione del danno al DNA.