Altri inibitori della LRRK2 a piccola molecola, potenti, selettivi, che

CAPITOLO 2 : Inibitori della chinasi LRRK2 e loro

2.2 Altri inibitori della LRRK2 a piccola molecola, potenti, selettivi, che

Un altro gruppo di ricercatori ha dimostrato in vivo l'inibizione dell’autofosforilazione della LRRK2 sulla Ser1292

nel cervello di topi transgenici usando un composto potente, selettivo e che supera la barriera ematoencefalica (composto 7, Tabella 2.3) [48]. La moderata concentrazione

Tabella 2.3 Aminopirimidine con sostituzioni sul C4 e C5

comp. R1 R2 CNS MPO score

LRRK2 Kia(nM)

LLE LELP JAK2 selectivity Indexb pLRRK2: IC50c(nM) 1 Cl NHMe 5,4 3 6,6 4,2 >1067 29 2 Cl OMe 5,6 9 5,7 5,3 >360 69 3 Br NHMe 5,1 2 6,8 4,3 1546 13 4 Br OMe 5,2 5 6,0 5,4 >661 53 5 F NHMe 5,5 58 5,8 3,6 >55 418 6 CN NHMe 4,7 11 6,9 2,4 >288 105 7 CF3 NHMe 5,1 2 6,6 5,0 >1928 9 a

plasmatica totale (∼150nM) del composto 7 e lasuaconcentrazione cerebrale (∼100 nM), richieste per inibire significativamente l'attività chinasica della LRRK2 in vivo, forniscono un’ulteriore supporto per la LRRK2 come target potenzialmente “utile” per il Parkinson.

Lo stesso gruppo di ricercatori ha riportato uno studio di modelling per omologia della LRRK2 basato sulla JAK2 (Janus chinasi 2) che è stato usato per individuare parecchi residui amminoacidici nei siti di legame che impartiscono la generale selettività chinasica [49]. Con un'analisi MMPs-cliffs (matched molecular pair activity cliff analysis) è stato possibile identificare un

amminoacido vicino alla regione cerniera (Leu1949) come un hotspot di selettività [50].

Come illustrato in Figura 2.14, i sostituenti piccoli in orto, come il gruppo metossilico in posizione 2 e 4 della diaminopirimidina (1), sono ben tollerati nella LRRK2 ma non sono tollerati nella JAK2 e in circa altre 290 chinasi che contengono un grande residuo di Phe o di Tyr in questa regione del sito di legame vicino alla cerniera [51,52]. Questa rivelazione ha permesso ai ricercatori di fare una progettazione di farmaci basata sulla struttura (structure

Figura 2.14 Modello di docking del composto 1 (ciano) nella LRRK2 (verde, Leu1949 in giallo). Si vedono anche la catena laterale della Tyr931 della JAK2 (magenta) e le interazioni di legami a idrogeno intermolecolari (linee gialle punteggiate) [48].

-based drug discovery) per ottimizzare con successo una serie di inibitori

diaminopirimidinici che hanno condotto all’identificazione del composto 1 come un inibitore a piccola molecola della LRRK2 potente, selettivo e che supera bene la BEE. Il composto 1, è stato usato per dimostrare in vivo l'inibizione di fosforilazione della Ser910 e Ser935 nel cervello di topo [53].

Il composto 1 ha una potenza biochimica LRRK2 di 3 nM (Tabella 2.3), un indice biochimico di selettività JAK2 >1067 ed inibisce soltanto la WT- LRRK2 e il mutante G2019S più del 50% a dose di 1μM (345 volte sopra la Ki) in un panel rappresentativo di Invitrogen di 63 chinasi. Allo stadio attuale di lead optimization, l'analisi biochimica JAK2 si è rivelata come un barometro utile per la selettività chinasica. Per determinare l'attività cellulare del composto 1, è stata misurata l'inibizione di autofosforilazione della LRRK2 in cellule HEK293 (cellule embrionali renali umane). La IC50 cellulare di fosfo-LRRK2 (pLRRK2) del composto 1 è risultata 29 nM (Tabella 2.3). Inoltre sono state valutate le relazioni struttura-attività (SARs) delle posizioni 4 e 5 delle aminopirimidine. Gli studi effettuati su alcuni composti (Tabella 2.3) hanno indicato una buona attività biochimica (<10 nM) e cellulare (<70 nM) per sostituenti come bromo, cloro o trifluorometile in posizione 5. La spiegazione di questa osservazione può essere dovuta al fatto che i gruppi in C5 con elevata lipofilia e dimensione possono interagire meglio con il residuo Met1947(residuo gatekeeper). In aggiunta, tutti gli esempi in Tabella 2.3 possiedono il punteggio desiderabile della SNC ottimizzazione multiparametrica (SNC MPO) [54] e sono altamente efficienti come misurato dall’efficienza lipofila del ligando (LLE) e dall’efficienza del ligando dipendente dalla lipofilia (LELP), parametri con risultati che sono in conformità con i farmaci SNC di marketing e i candidati clinici [55,56]. Il composto con la combinazione ottimale C4/C5 è l’aminopirimidina C4- trifluorometil/C5-aminometil sostituita (composto 7, pLRRK2 IC50 di 9 nM).

L'introduzione del gruppo trifluorometilico in C5 del composto 7 fornisce un contatto lipofilo ottimale con la Met gatekeeper e aumenta l'attività

verso la LRRK2. Inoltre, è stato ipotizzato che il gruppo trifluorometilico in C5 conferirebbe un profilo DMPK (Drug Metabolism Pharmacokinetic profile) più favorevole rispetto ad altri sostituenti in C5 a causa della diminuzione relativa del potenziale di ossidazione del sistema dell'anello pirimidinico. L’elevata lipofilia del gruppo trifluorometilico dovrebbe anche favorire la penetrazione attraverso la barriera ematoencefalica.

Per verificare questa ipotesi, sono stati valutati i profili DMPK dei composti 1-7 (Tabella 2.4) [48].

Tabella 2.4 Profili farmacocinetici delle aminopirimidinea in vitro e in vivo comp. Clhep b h/rc % rat PPB Cl (Clu) d iv t1/2 (h) F (%) MDR1e Papp A-Bf (∙10-6cm/s) MDR1 P-gp ERg (B-Ah/A-Bf) Bu/Pui CSF/Pul 1 4,9/24,3 91,8 51 (616) 0,46 64 4,4 2,8 0,17 0,29 2 1,8/4,4 94,6 9,8 (183) 0,83 106 8,2 0,8 0,23 0,84 4 12/16 96,6 5,7 (167) 0,67 58 5,6 1,4 0,10 0,18 6 2,1/5,4 83,5 4,4 (27) 1,1 117 3,1 6,8 0,08 0,19 7 1,8/7,6 86,3 24 (156) 1,2 80 18,2 1,2 0,50 0,48 a

Dose per os (1 mg/kg) come sospensione in MCT e per iv (0,5 mg/kg) come soluzione PEG al 60% o soluzione NMP al 20% o 60% per lo studio farmacocinetico sistemico e soluzione NMP al 60% per lo studio farmacocinetico cerebrale. bStabilità in vitro in epatociti criopreservati (ml min-1 kg-1). ch/r = human/rat. dClu = unbound clearance (ml min-1 kg-1) = clearance totale/[(100 - % rat PPB)]. eMDCK-

MDR1 P-gp umana in linee cellulari transfettate. fA-B, apicale-basolaterale. gRapporto di efflusso.

B-A, basolaterale- apicale. iRapporto Unbound brain/unbound plasma AUC. lRapporto CSF/unbound plasma AUC.

Lo studio farmacocinetico in vivo è stato eseguito nei ratti. Per valutare la penetrazione cerebrale di composti multipli, è stato utilizzato un approccio

cassette dosing che ha fornito i valori di AUC ratio di cervello (B), plasma (P)

e CSF (fluido cerebrospinale) misurati a 0,25, 1 e 3 h [57]. Usando in vitro i valori di BPB (Brain Protein Binding) e di PPB (Plasma Protein Binding), sono stati convertiti i rapporti cervello/plasma totali (B/P) e CSF/plasma totali (CSF/P) nei rapporti cervello/plasma non legato (Bu/Pu) e CSF/plasma non legato (CSF/Pu). Questa metodologia si è dimostrata una risorsa estremamente critica per il programma eseguito dai ricercatori ed ha permesso la generazione

rapida di correlazioni significative tra il rapporto di efflusso MDR1 (proteina di resistenza multifarmaco 1) in vitro e la concentrazione cerebrale non legata in vivo per la progettazione chimica di nuovi farmaci e la valutazione degli inibitori.

Negli esperimenti farmacocinetici iniziali, il lead aminopirimidinico (1) è stato rimosso rapidamente dal plasma ed ha dimostrato una riduzione sostanziale di penetrazione cerebrale (Bu/Pu = 0,17, Tabella 2.4). La ridotta penetrazione al SNC era coerente con un moderato rapporto di efflusso MDR1 [ER (B−A)/(A−B) = 2,8)]. Mentre questo entra in contrasto con il rapporto precedentemente riferito Bu/Pu di 0,61 nel topo, anche gli studi con topi knock- out P-gp/Bcrp hanno suggerito che il composto 1 fosse un substrato di efflusso. Inoltre il composto 1 ha causato una potente inibizione tempo- dipendente (TDI) del CYP1A2. Convertendo il C4 aminometile (1) in C4 metossi (2), è stato possibile rimuovere un donatore di legame a idrogeno (HBD) e raggiungere una riduzione della clearance totale di 5 volte eliminando anche le preoccupazioni per la TDI. Ulteriormente, questa modificazione ha migliorato la permeabilità passiva (A−B da 4,4 a 8,2×10−6 cm/s, Tabella 2.4) ed ha attenuato l’efflusso della P-gp (ER da 2,8 a 0,8, Tabella 2.4). Purtroppo, è stato scoperto che la maggior parte degli analoghi C4 metossilici si legano molto alle proteine del cervello (alto BPB) e danno dei rapporti Bu/Pu subottimali. Per il composto 6, sono stati osservati valori di Clu (unbound clearance) estremamente piccoli (27 ml min

−1

kg−1) insieme ad una perdita di esposizione cerebrale (Bu/Pu = 0,08) come previsto dai dati in vitro di MDR1 (ER = 6,8) e ad una limitata attività cellulare (105 nM, Tabella 2.3); ciò ha portato a non considerare i C5-ciano derivati.

Il composto 7 ha mostrato un buon equilibrio fra la stabilità in vivo, l'esposizione orale e la penetrazione a livello cerebrale. La buona penetrazione di questo composto nel SNC è stata raggiunta nonostante la presenza di due gruppi donatori di legame a idrogeno e una funzione ammidica, di cui entrambi possono essere considerati requisiti indesiderabili per

l'attraversamento della barriera ematoencefalica. Tuttavia, la struttura cristallina ai raggi X di 7 (Figura 2.15) suggerisce che i legami a idrogeno intramolecolari sono formati fra un atomo di fluoro del gruppo trifluorometilico in C5 e l’NH del gruppo aminometilico in C4 [58], come pure l’NH dell'anilina ed il gruppo metossilico. Queste interazioni probabilmente aumentano la permeabilità passiva e riducono la suscettibilità al efflusso dalla P-gp o da altri trasportatori [59]. La struttura cristallina conferma anche il ruolo del gruppo ammidico nel ridurre la planarità, che è importante per migliorare la solubilità e minimizzare l’inibizione del CYP. Il composto 7 è inoltre stabile negli epatociti umani (Clhep = 1.8 ml min−1 kg−1) ed i livelli di CSF del ratto sono ben correlati con la concentrazione cerebrale

Figura 2.15 Struttura cristallina ottenuta dai raggi X del composto 7 con legami a idrogeno

intramolecolari (linee verdi punteggiate) [48].

non legata. Questi dati, insieme all'analisi PK/PD del composto 7, che ha mostrato in vivo una forte inibizione dell’autofosforilazione della LRRK2 a livello della Ser1292 nel cervello di topi G2019S transgenici, hanno fornito un supporto importante per una ulteriore definizione del profilo di 7 e di altri composti ad esso strutturalmente correlati.

L’iniziale Invitrogen profiling di selettività chinasica del composto 7 a 0,1 μM (178 chinasi, 60 volte sopra la LRRK2 Ki; 0 chinasi ad inibizione >50%) ed a 1 μM (63 chinasi, 600 volte sopra la LRRK2 Ki; 0 chinasi ad inibizione >80%) dimostra che il composto 7 è un inibitore altamente selettivo

per la LRRK2. Successivamente, i ricercatori hanno valutato di nuovo le sequenze del sito di legame all’ATP di tutte le chinasi umane per identificare quelle che hanno sia un'elevata identità di sequenza a livello del sito di legame con l’ATP con la LRRK2 che una combinazione di Met gatekeeper e un piccolo residuo, come Leu, Val, Cys, o Ala nella posizione Leu1949. Sono state trovate 41 chinasi che hanno risposto a questi criteri. Dalle 11 chinasi che erano disponibili a Invitrogen e non erano state rappresentate nei panel originali, solo la TTK (MPS1) è stata inibita da alcuni composti [48]. Il composto 7, per esempio, inibisce l'attività di TTK del 55% a 0,1 μM e del 98% a 1μM. Un'analisi Lanthascreen di TTK ha fornito una Ki di 25 nM per il composto 7, che si traduce in un indice biochimico di selettività TTK di 13×[60]. A causa dell'omologia strutturale fra la LRRK2 e la TTK e a causa della tossicità potenziale i ricercatori hanno deciso di aumentare l’indice di selettività per la TTK. Nel tentativo di fare ciò, mantenendo le porzioni molecolari importanti del composto 7, sono state esaminate le differenze dei residui aminoacidici del sito di legame dell'inibitore fra la struttura cristallina nota della TTK (codice PDB 3GFW) [61], il modello per omologia della LRRK2 ed il composto 7 ancorato alla TTK (Figura 2.16).

Il residuo di Cys604 della TTK è più piccolo del residuo Leu1949, sostenendo la mancanza di selettività attribuita al gruppo o-metossilico che serve da “chiave” di selettività per molte chinasi con residui più grandi in questa posizione. Inoltre, sia la TTK che la LRRK2 hanno Met gatekeepers. Tuttavia, l’analisi ha suggerito che sia possibile sfruttare la differenza tra i residui di Ser1954 (LRRK2) e Asp608 (TTK) aggiungendo sostituenti sul C5ʹ dell'anello fenilico (in posizione para rispetto al gruppo metossilico) ed introducendo delle interazioni steriche ed elettrostatiche sfavorevoli con l’ingombrante catena laterale dell’Asp608

caricato negativamente. La distanza stimata tra il C5ʹ del composto 7 e l'ossigeno carbossilico della catena laterale dell’Asp608

è circa 3,9 Å. Quindi, lo scontro di sostituenti relativamente piccoli con la catena laterale dell’Asp608 fornisce un indice maggiore di selettività per

Figura 2.16 Differenze di residui-chiave tra il modello per omologia della LRRK2 (verde) e la

struttura ottenuta dai raggi X della TTK (magenta) con il composto 13 (ciano) nella TTK. Con le linee gialle punteggiate si mostrano i legami a idrogeno tra il residuo Gly605 e il composto 13. La freccia rossa indica la distanza misurata tra il C5ʹ del composto 13 e l’ossigeno carbossilico della catena laterale del Asp608 [48].

la TTK.

Oltre alla mancanza di selettività per la TTK, è stato scoperto che il composto 7 induce la formazione di micronuclei a basse concentrazioni in un'analisi in vitro su linfociti di sangue periferico umano e in uno studio del micronucleo nel topo in vivo a dosi multiple. Mentre la TTK non è stata precedentemente implicata nella ricerca di genotossicità in vitro [47], il ruolo della TTK nei checkpoints del ciclo cellulare ha suscitato una certa preoccupazione sul fatto che la genotossicità in vitro potrebbe essere legata all’inibizione della TTK inducendo i ricercatori a identificare composti con maggior TTK selettività. Quindi sono stati progettati inibitori a piccola molecola sostituiti in posizione 5ʹ del fenile (Tabella 2.5) [48].

I derivati 5ʹ-cloro (8, Tabella 2.5) e 5ʹ-metossi (9, Tabella 2.5) fenil sostituiti del composto 7 hanno chiaramente sostenuto l'ipotesi di selettività TTK e l'indice biochimico di selettività TTK è aumentato da 13× in 7 a 53× e a 275× rispettivamente in 8 e 9. Questi composti hanno inoltre mantenuto le attività cellulari LRRK2 (7 e 21 nM). Valori discreti di selettività su JAK2 e TTK erano stati ottenuti con la sostituzione del cloro in C2ʹ e il metossile in

Tabella 2.5 Ricerca preliminare della 2ʹ,5ʹ sostituzione per incrementare la selettività TTK comp. R1 R2 R3 LRRK2 Kia(nM) JAK2 selectivity Indexb TTK selectivity indexc pLRRK2: IC50c(nM) 7 Me OMe H 2 >1928 13 9 8 Me OMe Cl 2 >1368 53 7 9 Me OMe OMe 1 >2540 275 21 10 Me Cl OMe 4 >808 105 24 11 Et Cl OMe 3 >1096 77 27 a

Analisi biochimica. b(JAK2 Ki)/(LRRK2 Ki). c

(TTK Ki)/LRRK2 Ki). d

Analisi cellulare.

C5ʹ (10 e 11). Un profiling chinasico espansivo (189 chinasi) alla dose di 1 μM ha dimostrato eccellente selettività per entrambi i composti 10 (250 volte sopra la LRRK2 Ki; 0 chinasi ad inibizione >75%) e 11 (345 volte sopra la LRRK2 Ki; soltanto due chinasi ad inibizione >80%). Quindi, le analisi biochimiche TTK e JAK2 sono state comprese nello screening come off- target counterscreens e utilizzati come potenti indicatori di selettività chinasica generale per i nuovi composti.

Successivamente sono stati valutati i profili DMPK in vivo ed in vitro degli analoghi 2ʹ,5ʹ fenil sostituiti 8-12 (Tabella 2.6) [48]. Il legame alle proteine plasmatiche del composto 8 è risultato inaspettatamente alto, con clearance del composto non legato Clu (551 ml min

−1

kg−1) 3,5 volte superiore rispetto al composto 7 ed un inaccettabile rapporto Bu/Pu di 0,11.

Malgrado il leggero efflusso MDR1 con la linea cellulare P-gp umana, il dimetossi analogo 9 ha dimostrato un profiloin vivo paragonabile a quello del composto 7.Mentre gli studi in vitro con glutatione non hanno rivelato addotti covalenti con il composto 9. La eccellente penetrazione cerebrale del composto 10 è risultato promettente (Bu/Pu = 0.72); tuttavia, una grande

Tabella 2.6 Profili farmacocinetici in vivo e in vitro nel ratto delle aminopirimidine 2',5' fenil sostituite 8-12a

comp. Clhep b , h/rc % rat PPB Cl (Clu) d iv t1/2 (h) F (%) MDR1e Papp A-B f (∙10-6cm/s) MDR1 P-gp ERg (B-Ah/A-Bf) Bu/Pui CSF/Pul 8 2,8/22 99,1 4,7 (551) 1,1 8,1 1,9 0,11 0,41 9 0,8/15,2 91,4 15m (170) 1,2 101 4,4 3,4 0,80 2,0 10 0,8/3,7 90,8 59m (640) 0,83 48 10,4 1,1 0,72 1,8 11 0,9/26 96,3 19m (514) 1,2 47 8,3 1,6 0,77 2,9 12n 5,7/14 95,5 10m (227) 2,5 66 8,5 1,3 a

-1

kg-1) = clearance totale/[(100 - % rat PPB)]. eMDCK- MDR1 P-gp umana in linee cellulari transfettate. fA-B, apicale-basolaterale. gRapporto di efflusso.

B-A, basolaterale- apicale. iRapporto Unbound brain/unbound plasma AUC. lRapporto CSF/unbound plasma AUC. mClearance ematica. nAnalogo di 11( morfolina-d8)

disconnessione in vitro−in vivo (iviv) ha portato ad una clearance più elevata del flusso ematico epatico. Come risultato della significativa N-demetilazione, osservata dagli studi in vitro sull’identificazione di metaboliti, è stato preparato l’aminoetil analogo di 10 (11). Il composto 11 presenta una clearance totale ridotta pur mantenendo una penetrazione cerebrale paragonabile. Entrambi i composti (10 e 11) hanno mostrato in vitro un elevato metabolismo ossidativo dell'anello morfolinico. Quindi, nel tentativo di ridurre ulteriormente il turnover metabolico, è stato sintetizzato l’analogo morpholinico-d8 di 11 (12). Il composto 12 presenta una clearance significativamente più bassa, presumibilmente a causa degli effetti cinetici dell'isotopo deuterio.

Come precedentemente citato, il composto 7 ha mostrato genotossicità a basse concentrazioni. Di conseguenza, i composti 10 e 11 sono stati scelti per le analisi in vitro di genotossicità sui linfociti di sangue periferico umano. Mentre entrambe le molecole non inducono la formazione di micronuclei, un'incubazione del composto 11 con la frazione S9 ha rivelato la formazione di metaboliti potenzialmente clastogenici.

A questo punto, i ricercatori hanno stabilito le correlazioni affidabili di stabilità metabolica e permeabilità iviv con una vasta gamma di aminopirimidine, comprese quelle già illustrate. Queste correlazioni sono state utilizzate per selezionare rapidamente nuove molecole precedentemente sintetizzate per la loro valutazione in vivo e le loro proprietà fisico-chimiche hanno fornito delle linee guida utili nella fase di progettazione. Per esempio, l'analisi retrospettiva ha rivelato che gli analoghi con un cLogD (pH 7,4) compressa fra 1,8 e 3,3 hanno la più alta probabilità (60%) di essere metabolicamente stabili negli epatociti umani. Mentre gli inibitori con un cLogD < 1,8 hanno dimostrato buona stabilità, ma la maggior parte di questi composti erano substrati di efflusso dellaP-gp. La maggioranza degli analoghi con TPSA < 90 hanno mostrato una bassa tendenza di efflussoP-gp(l’85% ha dato un rapporto di efflusso <3). Quindi, l'applicazione dei parametri progettuali (1,8 < cLogD < 3,3 e TPSA < 90) per gli analoghi futuri in questa serie è stata adottata per aumentare la probabilità di successo ed infine per ridurre il numero dei composti da sviluppare.

Quindi sono state ulteriormente ottimizzate alcune molecole a struttura aminopirimidinica che già dimostrano attività, selettività e profili ADME (Assorbimento Distribuzione Metabolismo Escrezione) abbastanza buoni. Per questo scopo sono stati progettati dei modelli alternativi di fenil sostituzione indicati nella Tabella 2.7 [48]. I C5ʹ metil analoghi 13 e 14 hanno mostrato buona selettività per la TTK, insieme ad una buona attività cellulare per la LRRK2. Nel tentativo di mantenere i valori accettabili di selettività, riducendo sia il peso molecolare che la lipofilia, sono state studiate varie combinazioni metossile/fluoro (15-19, Tabella 2.7). Il composto 15 ha mostrato una selettività chinasica eccellente contro 189 chinasi alla dose di 1 μM(135 volte sopra la LRRK2 Ki; 0 chinasi ad inibizione >75%); tuttavia, l'attività cellulare per la LRRK2 (63 nM) era subottimale. Il composto 16, nel quale manca il sostituente in C5′, era meno selettivo per la TTK rispetto al composto 7 confermando la necessità di un sostituente in questa posizione.

Tabella 2.7 SAR della sostituzione in posizione 2ʹ,3ʹ,5ʹ del fenile delle aminopirimidine comp. R1 R2 R3 R4 LRRK2 Kia(nM) JAK2 selectivity Indexb TTK selectivity indexc pLRRK2: IC50d(nM) 13 Me Cl Me H 7 >489 78 43 14 Me OMe Me H 2 >1871 387 11 15 Me F OMe H 7 189 106 63 16 Me OMe H F 12 >262 11 35 17 Me OMe F H 6 >533 62 16 18 Et OMe F H 1 >3200 53 9 19 cPr OMe F H 1 >3200 118 4 a

Analisi biochimica. b(JAK2 Ki)/(LRRK2 Ki). c

(TTK Ki)/LRRK2 Ki). d

Analisi cellulare.

Lo spostamento del fluoro da C3ʹ a C5ʹ (17) ha ristabilito l'indice biochimico di selettività per la TTK a un valore maggiore di 50× ed ha aumentato l’affinità per la LRRK2. Il mantenimento della disposizione metossile/fluoro in C2ʹ/C5ʹ e la variazione della sostituzione amino-alchilica R1 hanno portato le attività cellulari per la LRRK2 a una sola cifra nanomolare per l’inibitore GNE-7915 (18, 9 nM, R1

= aminoetile) e il composto 19 (4 nM, R1 = aminociclopropil).

Il profiling chinasico espansivo di Invitrogen (187 chinasi) a 0,1 μM sia per il composto 18 (100 volte sopra la LRRK2 Ki) che per 19 (250 volte sopra la LRRK2 Ki) ha mostrato solo l’inibizione della TTK maggiore del 50%. Inoltre, per il composto 18 è stato eseguito il profiling diselettivitàutilizzando il panel di binding competitivo DiscoverX KinomeScan [62] (392 chinasi) a 0,1 μM. Il binding di >50% di spostamento probe è stato individuato per 10 chinasi e di >65% soltanto per la LRRK2, TTK e ALK, sostenendo ulteriormente la selettività eccellente del composto 18 per la LRRK2. Il Cerep

recettore 5-HT2B con una inibizione >70% a 10 μM. Dalle analisi funzionali in vitro è stato confermato che entrambi i composti 18 e 19 sono antagonisti moderatamente potenti di 5-HT2B.

Successivamente, sono stati valutati i profili DMPK dei composti più promettenti della Tabella 2.7 (Tabella 2.8) [48]. Il composto 14 è stato moderatamente eliminato, come previsto dalle misure in vitro, con buona stabilità metabolica negli epatociti umani e ha mostrato buona penetrazione cerebrale in vivo. Il composto 17 ha mostrato una forte correlazione iviv riguardo alla clearance metabolica; tuttavia, il rapporto Bu/Pu di 0,15 è subottimale. Sia 18 che 19 hanno mostrato eccellenti profili DMPK in vitro e

Tabella 2.8 Profili PK delle aminopirimidine 14, 17-19a

comp Clhep b , h/rc % rat PPB Cl (Clu) d iv t1/2 (h) F (%) MDR1e Papp A-Bf (∙10-6cm/s) MDR1 P-gp ERg (B-Ah/A-Bf) Bu/Pui CSF/Pul 14 4,2/22 95,8 28 (667) 1,2 46 5,0 3,1 0,88 2,1 17 3,9/11 95,7 12 (279) 4,2 79 3,3 2,2 0,15 0,28 18 3,2/14 96,6 8,3 (244) 3,1 40 10,4 0,9 0,50 0,60 19 4,9/15 97,6 6,8 (296) 6,0 65 10,9 1,3 0,61 0,27 a

MDR1 P-gp umana in linee cellulari transfettate. fA-B, apicale-basolaterale. gRapporto di efflusso.

B-A, basolaterale- apicale. iRapporto Unbound brain/unbound plasma AUC. lRapporto CSF/unbound plasma AUC.

PK in vivo nel ratto: (a) turnover minimo negli epatociti umani; (b) bassi valori di clearance totale e non legata negli epatociti di ratto; (c) lunghe emivite e buona esposizione orale; (d) alta permeabilità passiva, nessun efflusso dalla P- gp umana e buona penetrazione cerebrale nel ratto. Avendo stabilito i profili dei composti 14, 18 e 19 come punti di riferimento, è stato effettuato un altro studio di SAR per scoprire learee specificheche potrebbero essere migliorate.

Poichè le ammidi sono spesso substrati della P-gp, un approccio per migliorare la penetrazione cerebrale dei composti lead sarebbe l’introduzione degli

isosteri ammidici quale il tetrazolo 20 (Tabella 2.9) [48]. Effettivamente, il composto 20 ha mostrato buona esposizione cerebrale (Bu/Pu = 0,65); tuttavia, la scarsa solubilità, la modesta attività cellulare per la LRRK2 e la leggera inibizione del CYP1A2 (TDI) hanno precluso ulteriori approfondimenti. Tetrazoli, triazoli, pirazoli simili ed altri eterocicli hanno mostrato un’esposizione cerebrale promettente, ma la maggior parte di essi presenta una combinazione di scarsa solubilità e inibizione tempo-dipendente di CYP1A2.

Tabella 2.9 Profili SAR e DMPK delle aminopirimidine 20-25a

Dose per os (1 mg/kg) come sospensione in MCT e per iv (0,5 mg/kg) come soluzione PEG al 60% o soluzione NMP al 20% o 60% per lo studio farmacocinetico sistemico e soluzione NMP al 60% per lo studio farmacocinetico cerebrale. bAnalisi biochimica. c(TTK Ki)/(LRRK2 Ki). dAnalisi cellulare. eClu

= unbound clearance = clearance totale / [(100 - % rat PPB) / 100]. fMDCK-MDR1 P-gp umana in linee cellulari transfettate. gRapporto di efflusso. hA-B, apicale-basolaterale; B-A, basolaterale-apicale.

Rapporto Unbound brain/unbound plasma AUC. jClearance ematica.

Come sostituzioni del gruppo ammidico sono stati studiati anche gli alchilsolfonati. Il rappresentante di questa serie, 21, ha mostrato buona stabilità in vivo e PK cerebrale (Bu/Pu = 0,70); tuttavia, gli alchilsolfonati sono

Nel documento Inibitori della chinasi LRRK2: un nuovo approccio terapeutico per la malattia di Parkinson (pagine 52-85)