ANALISI BLAST SULLE PYROSEQUENZE DEL GENE 16S DI PLEURONECTIFORMI ED ALTRI PESCI

Si riportano nei sottoparagrafi seguenti i report di BLAST ottenuti allineando contro il database nr di GenBank® le sequenze ottenute da ciascuna specie mediante Pyrosequencing™ (pyrosequenze). Riguardo alle specie per le quali si disponeva di più isolati per campione e le pyrosequenze ottenute fossero state identiche, è stato scelto un solo campione da sottoporre all’analisi BLAST. I report sono presentati in ordine di numero identificativo del campione assegnato in Tab. 3.8; analogamente all’analisi BLAST sui clupeiformi si presentano per primi i report delle specie non discriminabili univocamente e successivamente i report relativi alle specie univocamente discriminabili, all’interno di un unico sottoparagrafo.

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In generale l’analisi BLAST sui campioni di pleuronectiformi ha confermato quanto previsto in fase di progettazione dell’analisi primaria, e quanto visto nell’analisi Identifire™, ovvero la possibilità di identificare univocamente mediante tecnica Pyrosequencing™, tutte le specie di Soleoidei (Solea solea e Solea senegalensis) come anche le specie cosiddette di altri pesci (Pangasius hypophtalmus e Lates niloticus) a nostra disposizione. Le pyrosequenze di tutte queste specie si sono infatti rivelate chiaramente identificabili con differenze evidenti nell’identità di sequenza minima che si è verificata di volta in volta con specie diverse e sopprattutto con specie di pregio.

L’analisi BLAST ha infine confermato la suddivisione del subordine Pleuronectodei in due gruppi di specie in base all’identità di sequenza con la specie

Pleuronectes platessa o con le specie Limanda e Hippoglossoides.

Analisi BLAST sulle pyrosequenze di Pleuronectoidei

I report di BLAST in Fig. 4.16 e Fig. 4.17 hanno confermato l’impossibilità di discriminare tra loro i membri del subordine Pleuronectoidei e la suddivisione degli stessi nei due gruppi precedentemente discussi. L’analisi BLAST ha dimostrato inoltre che il Gruppo I dei pleuronectoidei (report BLAST in Fig. 4.16) non comprende, diversamente dall’atteso, la specie Reinhardtius hippoglossoides (Halibut della Groenlandia) poiché l’ottenimento di pyrosequenze così lunghe ha permesso lo sfruttamento di zone polimorfiche discriminanti a valle della regione di 30 nt sulla quale si è valutata la variabilità interspecifica in fase di disegno dei primer. Un altro genere compreso in questo gruppo è Cleisthenes, genere che ha distribuzione geografica ridotta alle sole coste del Giappone e quindi non è di alcun interesse ai fini della nostra analisi; inoltre la sequenza del gene CYTB di questo genere è assente in GenBank® e quindi non è stato possibile includere questa specie nel disegno di primer per l’Indagine secondaria. Osservando l’ultimo record del report in Fig. 4.16 si nota che il Gruppo I dei pleuronectoidei si differenzia dal Gruppo II per un 5% di divergenza a livello della pyrosequenza, equivalente a 2/41 nt nel tratto considerato.

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Fig. 4.16. Parte del report relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa del campione 9 di Limanda limanda.

Il Gruppo II di specie nel subordine Pleuronectoidei (Fig. 4.17) tramite analisi BLAST ha dimostrato di comprendere oltre ai generi Pleuronectes e Platichthys, anche i generi Pseudopleuronectes, Isopsetta, Lepidopsetta, Liopsetta, Parophrys e Psettichthys. Tali generi sono stati perciò inclusi nell’allineamento per il disegno di primer sul gene Cytb. Tra i generi sopracitati figurano molte specie la cui denominazione non è inclusa nel D.M. MIPAAF del 31/01/2008, tra cui alcune specie di alto valore commerciale le quali non sono tuttavia commercializzate nei nostri mercati, quali Pseudopleuronectes

herzensteini diffusa nel Pacifico Nord-occidentale, Pseudopleuronectes americanus

nell’Atlantico occidentale e Parophrys vetulus nel Pacifico orientale.

……..

Fig. 4.17. Parte del report relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa del campione 15 di Pleuronectes

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Come visto in precedenza nel paragrafo 4.1.5, il campione 16 di Pleuronectes

platessa è apparso non corrispondere ad alcuna delle sequenze di P. platessa finora

sequenziate e presenti nel nostro database Identifire; lo stesso campione è stato inoltre sottoposto ad indagine BLAST per confermare o smentire che la sequenza di questo isolato fosse unica. Il report BLAST in Fig. 4.18 ha confermato la singolarità di tale sequenza all’interno degli isolati di P. platessa finora sequenziati ma d’altra parte ha smentito la singolarità di tale sequenza a livello generale in quanto essa risulta identica alla sequenza di un isolato di Platichthys stellatus, un membro del Gruppo II dei pleuronectoidei.

Fig. 4.18. Parte del report relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa del campione 16 di Pleuronectes platessa.

Analisi BLAST sui campioni delle specie di Pleuronectiformi ed altri pesci identificabili come frodi

Il report BLAST riportato in Fig. 4.19 dimostra che l’Indagine primaria consente l’identificazione della Sogliola Indo-Pacifica come frode di sostituzione nonostante non consenta un’identificazione univoca a livello di specie. Il report BLAST ha messo infatti in luce l’identità della pyrosequenza del campione 39 di Paraplagusia bilineata con la sola sequenza della specie Eopsetta jordani, la quale è un pleuronectoideo diffuso nell’Oceano pacifico che al pari della Sogliola Indo-Pacifica presenta un discreto valore commerciale, ristretto alla zona d’origine, e la cui denominazione è perciò assente nel D.M. MIPAAF del 31/01/2008. L’indagine BLAST ha perciò confermato che la sequenza di

Paraplagusia bilineata si discosta dalle sequenze di Pleuronectoidei e Soleoidei di

pregio, rendendo possibile la sua identificazione come frode mediante Pyrosequencing™.

Fig. 4.19. Parte del report relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa del campione 39 di Paraplagusia

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Per quanto riguarda il campione 75 di Solea solea, l’indagine BLAST (report in Fig. 4.20) condotta sulla corripsondente pyrosequenza ha confermato la possibilità di discriminare la specie Solea solea da tutte le altre specie di sogliola oltre che da tutte le altre specie di pesci piatti tramite differenze consistenti sopprattutto a livello del

Query-coverage.

Fig. 4.20. Parte del report di relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa del campione 75 di Solea solea.

L’analisi BLAST sulla pyrosequenza ottenuta sul campione 98 di Pangasius

hypophtalmus (Fig. 4.21) ha dimostrato l’identificabilità del genere Pangasius mediante

Pyrosequencing™ sul gene 16S in quanto la differenza minima nel Query-coverage con hit appartenenti ad altri generi (Heteropneustes) è pari al 24%.

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Fig. 4.21. Parte del report relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa del campione 98 di Pangasius hypophtalmus.

Infine, il report BLAST in Fig. 4.22 relativo alla pyrosequenza del campione 87 di

Lates niloticus ha dimostrato l’identificabilità di tale specie mediante Pyrosequencing™

con una differenza minima nello score molto consistente e pari a 21.7 con le sequenze di altre specie presenti nella banca dati GenBank®, nella fattispecie con la sequenza di

Alepes kleinii, pesce della famiglia Carangidae diffuso in Oceania.

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4.2 INDAGINE SECONDARIA PER LA DISCRIMINAZIONE DI ENGRAULIS ENCRASICOLUS