INDAGINE SECONDARIA PER LA DISCRIMINAZIONE DI ENGRAULIS ENCRASICOLUS TRAMITE UNA PORZIONE GENOMICA VARIABILE

4.2.1 AMPLIFICAZIONE DI ENGRAULIS ENCRASICOLUS CON L’IMPIEGO DEI PRIMER EngraJEF ED EngraJER

L’amplificazione di una porzione genomica mitocondriale variabile sui campioni 106 e 107 di Engraulis encrasicolus e sul controllo negativo, il campione 109, con i primer EngraJEF ed EngraJER è riportata in Fig. 4.23. Tali primer hanno dimostrato di amplificare in maniera poco efficiente (banda di intensità lieve) il campione 109, controllo negativo, mostrando perciò specificità per il genere Engraulis, nonché specificità per la porzione genomica target, dato che l’amplificazione ha generato un solo frammento della lunghezza prevista di 291 pb; la banda degli amplificati si trova infatti al di sopra della banda del marker di lunghezza pari a 267 nt. I primer hanno dimostrato altresì di essere efficaci anche su un campione di acciuga lavorato quale il 107. Non è stato purtroppo possibile valutare l’efficacia della coppia di primer su campioni di Engraulis japonicus perché tale specie è di difficile reperibilità sui nostri mercati; abbiamo perciò inoltrato delle richieste di invio di campioni di tale specie, le quali tuttavia non sono ancora state evase.

4.2.2 PYROSEQUENCING™ SUI CAMPIONI 106 E 107 TRAMITE IL PRIMER EngraJES ED ANALISI DELLE PYROSEQUENZE TRAMITE SOFTWARE IDENTIFIRE™

Il report riassuntivo Identifire mostrato in Fig. 4.24 si riferisce all’allineamento delle sequenze ottenute sottoponendo a Pyrosequencing™ gli amplificati mostrati in Fig. 4.21. Si è deciso di allineare soltanto la porzione della sequenza la cui qualità è giudicata

Fig. 4.23. Gel elettroforesi in

agarosio al 2% degli ampliconi del gene cytb amplificati con i primer

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good secondo i parametri del software Pyro Mark™ ID. Le pyrosequenze ottenute sono

state inequivocabilmente identificate come appartenenti ad Engraulis encrasicolus, questo si nota ancora meglio nel report dettagliato relativo al campione 106 riportato in Fig. 4.24, nel quale ben 5 SNP differenziano la sequenza ottenuta da quella di Engraulis

japonicus, nonostante questo non si raggiunge un’identità del 100% tra la query e le hit

depositate nel database locale. Questo si deve alla variabilità della regione considerata, a causa della quale, le sequenza degli isolati di cui disponiamo si discostano da quelle degli isolati finora sequenziati; in particolare si può notare in Fig. 4.25 la presenza di uno SNP a livello del secondo nt della pyrosequenza nell’allineamento con la hit appartenente ad Engraulis encrasicolus.

Infine, l’assenza di hit per la sequenza corrispondente al campione 109 in presenza del primer di sequenziamento, ha dimostrato ancora una volta la specificità dell’analisi per il genere Engraulis.

Fig. 4.24. Report riassuntivo della seduta di Pyrosequencing™ condotta con il primer di sequenziamento EngraJES sugli

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Fig. 4.25. Report dettagliato relativo alla pyrosequenza completa del campione 106 di Engraulis encrasicolus ottenuta

durante la seduta di Pyrosequencing™ il cui report riassuntivo è riportato in Fig. 4.24.

4.2.3 SEQUENZIAMENTO CON METODO CLASSICO SULLA PORZIONE GENOMICA DISCRIMINANTE DI ENGRAULIS

Poiché nell’Indagine secondaria per la discrimianzione di Engraulis encrasicolus l’analisi Identifire™ ha messo in luce la presenza di incogruenze tra le pyrosequenze ottenute e le sequenze depositate nel database locale, entrambi i campioni 106 e 107 sono stati sottoposti a sequenziamento con metodo tradizionale per verificare la corrispondenza, per lo stesso campione, tra la pyrosequenza full-sequence e la sequenza ottenuta mediante sequenziamento con metodo classico. Per il campione 106 il sequenziamento classico ha avuto successo su entrambi i filamenti mentre è stato efficace sul solo filamento reverse nel caso del campione 107.

In Fig. 4.26 viene presentato l’allineamento tra le sequenze ottenute con metodo classico su entrambi i campioni di engraulidi 106 e 107, a confronto con le sequenze

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ottenute in Pyrosequencing™ sul corrispondente campione. Questo permette di apprezzare l’assoluta corrispondenza di entrambe le pyrosequenze con le corrispondenti sequenze da sequenziamento classico, eccetto a livello del penultimo nucleotide della pyrosequenza 106 in corrispondenza del quale si verifica un plus-frameshift, si tratta comunque di un errore trascurabile dato che avviene 36 nt downstream al primer di sequenziamento, cioè al di fuori della regione di massima efficienza del Pyrosequencing™ ed anche al di fuori della regione polimorfica discriminante.

Fig. 4.26. Allineamento tra le sequenze ottenute con metodo classico su entrambi i campioni di engraulidi 106 e 107, a

confronto con le corripsondenti sequenze ottenute in Pyrosequencing™. In giallo si evidenzia la regione relativa al primer di sequenziamento EngraJES.

4.2.4 ANALISI BLAST SULLE PYROSEQUENZE DEGLI ENGRAULIDI OTTENUTE TRAMITE IL PRIMER EngraJES

La sequenza riportata nel pirogramma in Fig. 4.25 privata della regione terminale in cui si verifica come visto una riduzione nell’efficienza, è stata sottoposta ad analisi BLAST, il cui report è riportato in Fig. 4.27. Tale report ha confermato che la pyrosequenza ottenuta discrimina univocamente il corrispondente isolato come appartenente ad Engraulis encrasicolus. Il Query-coverage che si ottiene per la hit migliore è pari 94% poiché la presenza di uno SNP a livello del secondo nucleotide ha indotto l’algoritmo ad escludere dall’allineamento i primi 2 nucleotidi della query. Tale hit migliore appartiene ad Engraulis encrasicolus ed è anche l’unica che si ottiene per il genere Engraulis. Questo dimostra che l’Indagine secondaria progettata per la discriminazione di Engraulis encrasicolus da Engraulis japonicus è molto specifica e non viene pregiudicata dalla comparsa di mutazioni.

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> dbj|AP009137.1| Engraulis encrasicolus mitochondrial DNA, complete genome

Length=16674

Score = 67.9 bits (34), Expect = 2e-09 Identities = 34/34 (100%), Gaps = 0/34 (0%) Strand=Plus/Minus

Query 3 GTAAGGGGTGGTAGGCCACCTAAGGATAGAAGAA 36 |||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4822 GTAAGGGGTGGTAGGCCACCTAAGGATAGAAGAA 4789

Fig. 4.27. Parte del report relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa ottenuta con il primer EngraJES sul

campione 106 di Engraulis encrasicolus ed allineamento a coppie con l’unica hit di Engraulis encrasicolus. L’analisi BLAST (report in Fig. 4.28) sulla pyrosequenza full-sequence del campione 107 conferma l’appartenenza anche di questo campione alla specie Engraulis

encrasicolus, nonostante in questo caso si verifichino due ulteriori SNP nella regione fino

dei primi 34 nt a valle del primer di sequenziamento.

La discriminazione dalla sequenza di Engraulis japonicus avviene grazie a 3 SNP a livello della stessa regione fino al 34^esimo nucleotide; poiché tali SNP cadono tutti e tre in regioni diverse rispetto ai due visti nell’allineamento con la hit AP009137, questo permette una discriminazione univoca tra le due specie.

>dbj|AP009137.1| Engraulis encrasicolus mitochondrial DNA, complete genome

Length=16674

Score = 48.1 bits (24), Expect = 0.002 Identities = 30/32 (93%), Gaps = 0/32 (0%) Strand=Plus/Minus

Query 3 GTAAGGGGCGGTAGGCCACCTAAGGACAGAAG 34 |||||||| ||||||||||||||||| ||||| Sbjct 4822 GTAAGGGGTGGTAGGCCACCTAAGGATAGAAG 4791

>dbj|AB040676.1| Engraulis japonicus mitochondrial DNA, complete genome Length=16675

Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.026 Identities = 31/34 (91%), Gaps = 0/34 (0%) Strand=Plus/Minus

Query 1 CTGTAAGGGGCGGTAGGCCACCTAAGGACAGAAG 34 ||||||||||||| ||||| ||||| |||||||| Sbjct 4825 CTGTAAGGGGCGGCAGGCCGCCTAAAGACAGAAG 4792

Fig. 4.28. Parte del report relativo all’analisi BLAST sulla pyrosequenza completa ottenuta con il primer EngraJES sul campione 107

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4.3 INDAGINE SECONDARIA PER LA DISCRIMINAZIONE DELLE SPECIE APPARTENENTI AL