Analisi bromatologica

L’analisi bromatologia è stata effettuata presso il Dipartimento di Scienze Agrarie- Alimentari e Agroambientali (Università di Pisa).

Sono stati presi in considerazione i campioni di polline di frassino, castagno e millefiori freschi, non sottoposti ad alcun trattamento termico.

3.3.1 Determinazione della sostanza secca e dell’umidità

La sostanza secca è stata determinata con metodo gravimetrico, come indicato nella Gazzetta Ufficiale (GU CEE L 279/8 del 20/12/71), attraverso la stima per pesata

della perdita in peso del campione, precedentemente sottoposto a essiccamento in stufa termostatata.

Per determinare la sostanza secca è stato prima tarato il contenitore con precisione di 0,5 mg, poi è stata pesata la capsula in ceramica tarata contenente 5 g di campione, che sono stati pesati con un’approssimazione massima di ± 0,1 mg.

La capsula è stata quindi posta nella stufa pre-riscaldata a 80-85°C, il campione è stato lasciato essiccare ad una temperatura di 103°C per 16 ore (una notte) in corrente d’aria calda. Poi, il campione è stato prelevato e posto a raffreddare in un essiccatore a piastra in porcellana, avente come disidratanti un gel di silice e Sali di cobalto, che essendo fortemente igroscopici, hanno assorbito parte dell’acqua presente nell’alimento.

Dopo circa 30-45 minuti il campione è stato quindi prelevato e pesato.

La determinazione della sostanza secca è stata quindi stimata per differenza di peso prima e dopo essiccamento in stufa.

Il valore della sostanza secca espresso in percentuale, ci ha permesso di ricavare per differenza il contenuto di umidità presente.

3.3.2 Determinazione delle proteine grezze

Il contenuto in proteine grezze si determina con il metodo Kjedahl quantificando l’azoto presente nel campione e utilizzando come fattore di conversione dell’azoto in proteine 5,6 (AAVV 1991).

Tale metodo si basa sulla quantificazione per titolazione del contenuto in azoto presente nel distillato, ottenuto dal campione sottoposto a mineralizzazione.

La prima fase del metodo consiste quindi nella mineralizzazione di tutta la sostanza organica, la quale è attaccata a caldo dall’acido solforico e dal perossido di idrogeno.

In un tubo da mineralizzazione sono stati prima trasferiti 200 mg di campione, essiccato a 65°C e macinato, poi sotto cappa sono stati aggiunti 3 ml di acido solforico (96%) e 1,5 ml di perossido d’idrogeno (30% m/m).

I tubi sono quindi stati sistemati nel digestore e coperti con il raccoglitore di fumo, la temperatura di 370°C e la presenza dell’acido solforico e del perossido d’idrogeno hanno determinato dopo 30 minuti la mineralizzazione della sostanza organica, inoltre allo scadere del tempo sono stati aggiunti 1,5 ml di perossido d’idrogeno necessari per una seconda ossidazione.

L’avvenuta mineralizzazione era osservabile per la completa decolorazione del liquido ottenuto.

Una volta mineralizzata tutta la sostanza organica, l’azoto proteico era presente come solfato d’ammonio, perciò l’aggiunta di basi durante la distillazione ha creato una condizione di alcalinità che ha separato lo ione solfato da quello ammonio.

Il tubo di mineralizzazione è stato inserito in un distillatore automatizzato (distillatore Kjeltek 2200), alla fine del processo durato circa 3 minuti, il distillato si è raccolto nella beuta, e, per aggiunta della soluzione di acido borico, il colore ha virato da rosso a verde. La soluzione di acido borico è stata preparata versando 6 L di acqua deionizzata in un pallone da 10 L, è stata quindi portata a ebollizione in 30 minuti, sono stati poi aggiunti 400 g di acido borico, infine una volta raffreddata la soluzione, sono stati aggiunti 3 L di acqua deionizzata.

Sono stati poi aggiunti al pallone contenente l’acido borico 100 ml di Verde di Bromocresolo 0,1% (soluzione alcolica) e 70 ml di Rosso di Metile 0,1% (soluzione alcolica); la soluzione borica è stata quindi portata a volume di 10 L.

Per distillazione della sostanza organica mineralizzata è stata ottenuta ammoniaca, che raccolta in una beuta contenente la soluzione borica ha virato da rosso a verde.

La quantificazione dell’ammoniaca è stata eseguita per titolazione acido-base con acido cloridrico 0,1 N, fino a viraggio a colorazione grigia.

3.3.3 Determinazione dei carboidrati

La determinazione dei carboidrati è stata effettuata per differenza, come proposto da Campos secondo la seguente formula (Campos, et al. 2008):

%𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑖= 100−(%𝑎𝑐𝑞𝑢𝑎+ %𝑃𝐺+ %𝐸𝐸+%𝐶𝑒𝑛.).

Dove: % acqua, umidità del campione; % PG, proteine grezze su tal quale; % EE, estratto etereo su tal quale; % Cen., ceneri su tal quale.

3.3.4 Determinazione delle ceneri

Il contenuto in ceneri, che un indice della componente inorganica nell’alimento, è stato determinato con il metodo analitico proposto in Gazzetta Ufficiale (GU CEE L 54/50 del 26/02/2009).

Il metodo prevede la taratura dei crogioli da incenerimento in porcellana e la pesata del campione, pari a 5 g, con un’approssimazione massima di 1 mg.

La capsula è quindi stata posta in forno a muffola, dove ha raggiunto per scala termica, la temperatura di 550°C determinando quindi l’incenerimento del campione.

Il campione è stato raffreddato in un essiccatore con piastra in ceramica, avente come materiale igroscopico un gel di silice e Sali di cobalto, e, dopo circa 30-45 minuti, è stato pesato.

Il peso del residuo in cenere è stato calcolato deducendone la tara del contenitore, rilevata nelle prime fase del procedimento, è stata poi determinata la quantità in ceneri esprimendola in percentuale del campione.

3.3.5 Determinazione dell’estratto etereo (grassi)

La determinazione dell’estratto etereo si esegue determinando la perdita in peso del campione essiccato e sottoposto a estrazione della componente di lipidica per mezzo dell’estrattore Ankom XT10.

La procedura analitica eseguita è quella proposta dall’Ankom technology, relativa all’estrazione con solvente ad alta temperatura per alimenti solidi.

Per la determinazione dell’estratto etereo è stato necessario procedere con la polverizzazione mediante pestello e mortaio degli agglomerati di polline, in seguito è stato pesato 1 g e trasferito all’interno di un piccolo sacchetto in nylon.

Con una termosaldatrice (5-6°C) il sacchetto è stato sigillato e quindi posto prima in stufa a 103 °C per 3 ore, poi in essiccatore per 30 minuti e in seguito pesato.

Il campione, una volta raffreddato, è stato inserito all’interno della camera d’estrazione dell’Ankom insieme a 350 ml di etere di petrolio, che funge da solvente d’estrazione della frazione lipidica.

Dopo un ciclo d’estrazione dalla durata di 1 ora, è stata prelevato il sacchetto e posto in stufa a 103°C per 30 minuti; il campione è stato infine pesato.