Analisi citologica dell’espettorato

Ogni paziente è stato sottoposto anche a raccolta dell’espettorato spontaneo per analisi citologica: in particolare, previa valutazione dell’adeguatezza del campione, è stata valutata la presenza percentuale di neutrofili ed eosinofili, in maniera da caratterizzare i soggetti secondo i principali ceppi leucocitari di risposta infiammatoria nelle vie aeree [70].

Il materiale raccolto viene diluito con un certo volume di tampone fosfato contenente ditiotreitolo allo 0,1% (Sputasol, Unipath, Ltd, Basingstoke, UK) e incubato per 10 minuti a 37◦C in un bagnetto termostato con agitatore per la fluidificazione degli aggregati di muco. In seguito vengono fatte ulteriori diluizioni con soluzione salina e incubazioni, dopodiché la soluzione ottenu- ta viene filtrata attraverso una garza in nylon con pori di 53 µm di diametro (Giuliani Filtrazioni, Torino, Italia) per eliminare eventuali detriti. Un’aliquo- ta di campione di espettorato (70-150 µL) è stata citocentrifugata per 5 minuti a 1300rpm (Cytospin; Shandon Scientific, Sewickley, PA) e colorata con Diff- Quik (Baxter Scientific Products, Miami, FL).

Due ricercatori, in cieco rispetto al codice del paziente e indipendentemen- te l’uno dall’altro, hanno contato un minimo di 500 cellule non squamose in ogni vetrino. Il conteggio di macrofagi, linfociti, neutrofili ed eosinofili è stato quindi espresso come valore percentuale di 500 cellule infiammatorie. La con- cordanza fra le due osservazioni è espressa come coefficiente di correlazione fra classi diverse, ed i valori definitivi sono stati ottenuti dalla media dei dati acquisiti nelle due osservazioni. I campioni in cui non è stato possibile rintrac- ciare almeno 300 cellule infiammatorie tra le 500 esaminate vengono scartati, in quanto considerati non attendibili.

Questa analisi è stata condotta presso il Laboratorio di Biologia Cellulare Re- spiratoria della Sezione a Valenza Dipartimentale Fisiopatologia Respiratoria e Riabilitazione Respiratoria Universitaria dell’AOUP.

3.2.10

Analisi della composizione corporea con

bioimpedenzometria

Allo scopo di caratterizzare la composizione corporea (in particolare per quan- to concerne la quantificazione della massa magra e di quella grassa) ogni sog- getto, presentatosi a digiuno, è stato sottoposto a bioimpedenzometria con strumento Akern BIA 101 - Bioelectrical Impedance Analyzer. La tecnica te- trapolare nell’analisi total body prevede il posizionamento di due coppie di elettrodi: una coppia sul dorso della mano (di solito la destra) a livello dell’ar- ticolazione metacarpo-falangea del III◦dito (elettrodo iniettore) e sull’articola- zione radio-ulnare (elettrodo sensore); l’altra coppia sul dorso del piede omo- laterale, con l’elettrodo iniettore sull’articolazione metatarso-falangea del III◦

dito e l’elettrodo sensore sull’articolazione tibio-tarsica. Alla fine della misura- zione, della durata di pochi secondi, lo strumento mostra i valori di Resistenza (RZ) e Reattanza (XC), ottenuti dall’iniezione di una corrente costante, sinu- soidale, a 50kHz e 400 microamperes di intensità [71]. Questi dati, integrati con l’età, il sesso, il peso e l’altezza del soggetto, sono stati inseriti nel software dedicato Bodygram Plus per il calcolo dei seguenti parametri derivati, espressi sia in % del peso corporeo sia in rapporto all’altezza (kg/m):

• Massa Magra (FFM - Fat Free Mass), compartimento comprendente lo scheletro, circa il 73% dei fluidi corporei, i muscoli, la pelle e gli organi. Una buona forma fisica presuppone un valore di FFM del 77-85% del peso corporeo ed è dipendente dall’età del soggetto;

• Massa Grassa (FM - Fat Mass), compartimento necessario sia come ri- serva energetica sia per il corretto svolgimento dei processi vitali, oltre a svolgere una funzione di protezione degli organi interni. È importante, tuttavia, che questo accumulo non oltrepassi i limiti fisiologici, cioè un valore di FM del 15-23% del peso corporeo in base all’età del soggetto.

3.3

Analisi statistica

Per l’analisi statistica dei risultati è stato utilizzato il programma IBM SPSS 20.0, assumendo come livello di significatività una p inferiore a 0,05.

ne non normale della maggior parte delle variabili in gioco, è stato scelto di tabulare i valori come mediana e valori minimo e massimo, e per i confronti tra variabili sono stati usati test non parametrici. In particolare, per i con- fronti fra due gruppi indipendenti è stato utilizzato il test di Kolmogorov- Smirnov, mentre per la ricerca di relazioni tra le variabili è stato eseguito il test di correlazione di Spearman, sempre per dati non parametrici.

4

Risultati

4.1

Caratteristiche basali del campione in studio

Il campione in studio è composto da 24 soggetti affetti da BPCO in fase stabile di malattia con un rapporto maschi/femmine di 3:1.

In [Figura4.1] sono riportati i parametri antropometrici e clinici basali della popolazione in studio, in cui la fascia d’età e la storia di esposizione al fumo riflettono quanto atteso secondo i dati epidemiologici della malattia.

Un terzo dei soggetti ha una storia di frequenti riacutizzazioni nell’anno pre- cedente (≥2 riacutizzazioni/anno). Sono, inoltre, presentate le principali co- morbidità osservate nel campione, tra cui quelle maggiormente prevalenti si confermano essere l’ipertensione arteriosa, l’ipercolesterolemia, il sovrappeso e l’obesità, il diabete mellito di tipo II.

La [Figura4.2] mostra invece i parametri di funzione respiratoria, indicati sia come valore assoluto che come percentuale del valore predetto. Anche questi valori sono riportati come mediana e relativi valori minimo e massimo misu- rati in tutto il campione. La popolazione presenta un grado di ostruzione al flusso, definita dai valori di FEV1, mediamente di grado moderato (mediana 58%pred.). Per quanto riguarda la volumetria statica si registra la presenza di insufflazione polmonare con aumento del volume residuo (RV 152,50 %pred.), associata ad una riduzione della capacità di diffusione alveolo-capillare del monossido di carbonio (DLCO 70,50 %pred.), dati compatibili con l’impegno parenchimale di tipo enfisematoso.

A seguire viene presentata una suddivisione della popolazione in classi GOLD, sia in base alla classificazione secondo il grado di ostruzione (utilizzata nell’at- tuale documento del 2017) e che vede 15 pazienti appartenere al gruppo GOLD 1+2 (FEV1≥50 %pred.) e 9 al gruppo GOLD 3+4 (ostruzione al flusso aereo più grave con FEV1<50 %pred.), sia in base alla classificazione GOLD 2011 (la qua- le oltre a tenere conto dei valori del FEV1, considera i sintomi e il numero di riacutizzazioni nell’ultimo anno) nei gruppi ABCD.

Figura 4.1:Valori antropometrici e clinici basali, espressi come Mediana (Min; Max), della popolazione in studio e principali comorbidità espresse in valore assoluto (%).

mMRC: modified Medical Research Council; BMI: Body Mass Index; CAT: COPD Assessment Test; eGFR: estimated Glomerular Filtration Rate.

Figura 4.2: Parametri di funzione respiratoria, espressi come mediana (min; max), della popolazione in studio, classi GOLD 2017 e 2011. FEV1: volume espiratorio massimo nel 1◦ secondo (forced expiratory volume in 1 second); FVC: capacità vitale forzata (forced vital ca- pacity); SVC: capacità vitale lenta (slow vital capacity); RV: volume residuo (residual volume); TLC: capacità polmonare totale (total lung capacity); DLCO: capacità di diffusione alveolo-capillare del CO (diffusing capacity of the lung for CO).

Nella [Figura4.3], invece, sono riportati i valori dei principali biomarcatori mi- surati nel sangue e nell’espettorato della popolazione in studio. Mentre non è possibile esprimere una valutazione riguardo ai livelli delle microarticelle

(per le quali non esistono, al momento, dei valori di riferimento di normalità), possiamo osservare come mediamente la nostra popolazione non presenti ele- vazione dei più comuni indici di infiammazione sistemica: infatti, sia la conta totale dei globuli bianchi che i livelli di PCR e fibrinogeno ricadono nell’in- tervallo dei valori di normalità previsto dal laboratorio di analisi. Per quan- to concerne i dati relativi all’infiammazione nelle vie aeree, vediamo come i soggetti studiati mostrino un pattern infiammatorio prevalentemente di tipo neutrofilico.

Figura 4.3: Biomarcatori nel sangue e nell’espettorato, espressi come mediana (min; max), della popolazione in studio.

La [Figura4.4] mostra alcuni degli indici cardio-metabolici esaminati. Anche in questo caso, specialmente per quanto concerne i marcatori cardiovascolari circolanti, non si osservano valori mediani significativamente al di fuori degli intervalli di riferimento; la mediana dell’indice RHI (1,72), mostra come non ci sia un significativo livello di disfunzione endoteliale nella popolazione stu- diata, considerando che si parla di disfunzione endoteliale per valori di RHI ≤1,67, anche se 11 (45,8%) pazienti mostravano un valore inferiore a questo cut-off.

Figura 4.4: Parametri metabolici e cardiovascolari, espressi come mediana (min; max), della popolazione in studio. HOMA: Homeostasis Model Assessment, indice di insulino- resistenza; RHI: Reactive Hyperemia Index, indicatore di disfunzione endoteliale; WI: Wave Intensity, indice emodinamico globale di accoppiamento ventricolo-arterioso; 1st-W1: primo picco della Wave Intensity, indicatore dell’energia eiettiva miocardica in protosistole; 1st-2nd: tempo di eiezione ventri- colare sinistra; Ep: modulo elastico di Peterson, indicatore di rigidità arteriosa (stiffness); FC: frequen- za cardiaca; TD Mitral Sv Vel: velocità di accorciamento longitudinale miocardico al Tissue Doppler, fornisce informazioni quantitative sulla funzione ventricolare longitudinale sistolica.

4.2

Parametri relativi all’esercizio nel campione in

studio

Nella [Figura4.5] sono riportati i valori dei principali parametri relativi al test da sforzo cardiopolmonare incrementale, eseguito in occasione della V2. Per quanto concerne la soglia anerobica durante il test incrementale, essa è sta- ta raggiunta durante lo sforzo da 2 soggetti su 24 (8,3%), mentre 10 soggetti (41,6%) l’hanno raggiunta nell’immediata fase di recupero; nei restanti casi non è stato possibile determinarla.

Figura 4.5: Principali parametri misurati nel test da sforzo incrementale, espressi come mediana (min; max), della popolazione in studio. VO2peak: consumo massimo di ossigeno; VE/VCO2: rapporto tra ventilazione (VE) e produzione di anidride carbonica (VCO2); FC: frequenza cardiaca; O2pulse: polso d’ossigeno (=VO2peak/FC picco) Borg R: grado Borg della dispnea; Borg M: grado Borg della fatica muscolare; Sat.% Hb: saturimetria percutanea.

Figura 4.6: Cause principali di interruzione del test cardiopolmonare.

Relativamente alle cause di interruzione del test cardiopolmonare [Figura4.6] si vede che una fetta consistente della popolazione (38%) ha interrotto il test per dispnea, come atteso in una popolazione di soggetti affetti da BPCO, ri- spetto ai soggetti sani, nei quali più frequentemente il limite è rappresentato dall’esaurimento muscolare. Un terzo dei soggetti ha interrotto per fatica mu- scolare e una quota minore per entrambi i sintomi associati (dispnea e fatica muscolare). Nessun test è stato interrotto dal medico per ragioni di sicurezza e/o eventi avversi maggiori.

In [Figura4.7] sono riportati i dati principali del test del cammino dei sei minu- ti, come la distanza percorsa dai soggetti e la saturimetria percutanea all’inizio e alla fine del test. Durante l’esecuzione dei 24 test non si sono verificati eventi avversi maggiori.

Figura 4.7: Principali parametri misurati nel test del cammino dei sei minuti, espressi come mediana (min; max), della popolazione in studio.

4.3

Confronto dei biomarcatori tra gruppi

Una prima analisi è stata condotta mettendo a confronto il gruppo costitui- to dai pazienti appartenenti alle classi GOLD 1+2 con il gruppo dei pazienti GOLD 3+4, rispetto a una serie di biomarcatori di infiammazione sistemica, sia circolanti che nell’espettorato [Figura4.8].

Non si evincono differenze statisticamente significative in termini di micropar- ticelle di qualsiasi origine, mentre è risultata fortemente significativa (p=0,007) la differenza nei livelli di fibrinogeno tra i due gruppi: in particolare, questo indice di fase acuta mostra valori più elevati nei soggetti con funzione respira- toria meno compromessa (GOLD 1-2: FEV1≥50%).

La conta granulocitaria nell’espettorato, differenziata in neutrofili ed eosinofili, non ha mostrato differenze significative.

Figura 4.8: Gruppi divisi secondo FEV1 (GOLD 1-2: FEV1≥50%; GOLD 3-4: FEV1<50%).

È stata, inoltre, condotta una seconda analisi per gli stessi biomarcatori, questa volta mettendo a confronto i soggetti raggruppati secondo la classificazione GOLD 2011, paragonando soggetti nel gruppo D verso tutti gli altri soggetti [Figura4.9].

Figura 4.9: Gruppi divisi secondo il grado GOLD (A+B+C contro D).

Le EMP totali e di origine dal circolo sistemico, ma non quelle di origine pol- monare, sono risultate significativamente più alte nei pazienti di grado D (p=0,049 in entrambi i casi) rispetto al gruppo A-C [Figura4.10].

Le microparticelle di derivazione monocitaria mostrano, invece, solo una mo- destissima tendenza (p=0,085) ad avere livelli più alti nel gruppo D. Non si evidenziano, infine, differenze significative per gli altri parametri indagati.

Figura 4.10: EMP totali (a sinistra) e ad origine dal circolo sistemico (a destra) nei gruppi GOLD D vs A-C.∗p=0,049.

4.4

Correlazioni tra microparticelle ed indici

funzionali, cardiovascolari o di infiammazione

sistemica

Abbiamo ricercato correlazioni tra microparticelle di origine endoteliale (to- tali, sistemiche e polmonari) e microparticelle monocitarie rispetto ad alcuni parametri, come ad esempio la funzione respiratoria, i sintomi, la capacità di esercizio, la composizione corporea, i marcatori di danno cardiovascolare o di infiammazione sistemica.

Le EMP totali correlano in modo diretto con i sintomi espressi dal punteggio CAT (rho: 0,419; p=0,042) [Figura4.11], mentre le EMP di origine sistemica correlano sia con il punteggio CAT (rho: 0,418; p=0,042) che con il grado di dispnea secondo la scala mMRC (rho: 0,436; p=0,033) [Figura4.12]: quindi, più il paziente è sintomatico, più alto è il suo titolo di EMP plasmatiche. Analo- ga relazione, invece, non è presente per le microparticelle ad origine dall’en- dotelio polmonare. Per quanto riguarda la funzione respiratoria, non risulta una significativa correlazione con i valori di FEV1, c’è solo una certa tendenza ad una relazione inversa tra EMP totali e FEV1, così come tra EMP ad ori- gine dal circolo polmonare e FEV1 (in entrambi i casi p=0,07). Si osservano, inoltre, una tendenza ad una relazione inversa tra EMP di origine polmonare e consumo di ossigeno al picco del test cardiopolmonare - espresso in valo-

re assoluto - (p=0,07), così come tra MP di origine monocitaria e consumo di ossigeno al picco del test cardiopolmonare - espresso stavolta in percentuale del predetto - (p=0,053). Non sono presenti, invece, correlazioni significative tra microparticelle (sia di origine endoteliale che monocitaria) ed i principali parametri cardiovascolari, metabolici, di infiammazione sistemica, o altri pa- rametri di funzione respiratoria quali ad esempio la capacità polmonare totale o la capacità di diffusione alveolo-capillare del monossido di carbonio.

Figura 4.11: Correlazione tra EMP totali e punteggio CAT.

Figura 4.12: Correlazione tra EMP ad origine dal circolo sistemico e punteggio CAT (a sinistra); correlazione tra EMP ad origine dal circolo sistemico e dispnea secondo la scala mMRC (a destra).

4.5

Confronto tra gruppi GOLD per i dati

cardiovascolari

Per quanto riguarda i dati ricavati dalle valutazioni cardiovascolari, eseguite su tutti i soggetti in studio, abbiamo scelto di rappresentare i seguenti para- metri, più significativi, confrontati mediante il raggruppamento dei pazienti in classi GOLD ABCD e, in particolare, dal confronto A-C vs D.

Figura 4.13:Gruppi GOLD a confronto rispetto ad alcuni parametri cardiovascolari, espressi come Media (Deviazione Standard-DS).1st-W1: primo picco della Wave Intensity, indicatore dell’energia eiettiva miocardica in protosistole; 1st-2nd: tempo di eiezione ventricolare sini- stra; Ep: modulo elastico di Peterson, indicatore di rigidità arteriosa (stiffness); FC: frequenza cardiaca; TD Mitral Sv Vel: velocità di accorciamento longitudinale miocardico al Tissue Doppler, fornisce in- formazioni quantitative sulla funzione ventricolare longitudinale sistolica; RHI: Reactive Hyperemia Index, indicatore di disfunzione endoteliale.

Come si vede dalla [Figura4.13], i pazienti in classe GOLD D presentano una frequenza cardiaca basale, registrata in occasione della valutazione della ri- gidità arteriosa, significativamente maggiore rispetto al gruppo A-C (76bpm contro 65bpm, p=0,042); da segnalare, a questo proposito, che la portata cir- colatoria e la pressione arteriosa sono risultate assolutamente comparabili tra i due gruppi. Vi è poi una forte tendenza (p=0,06) ad una differenza nella valutazione dell’eiezione ventricolare sinistra (1st-2nd): i soggetti in classe D GOLD, infatti, mostrano un tempo di eiezione tendenzialmente ridotto rispet- to agli altri (240ms contro 264ms). Non si rilevano, invece, differenze signifi- cative per quanto riguarda gli altri parametri riportati. Infine, lo studio della disfunzione endoteliale con metodica EndoPAT non ha mostrato differenze de-

gne di nota tra i due gruppi. Non sono emerse significative differenze neppure confrontando i livelli di NT-proBNP e troponina circolanti tra i due gruppi in questione.

5

Discussione

5.1

Cos’è venuto al pettine...

Secondo quanto già illustrato nel capitolo dei risultati, sono emersi alcuni ele- menti interessanti, che potrebbero meritare, al di là dello scopo di questa tesi, un approfondimento ulteriore.

Le microparticelle endoteliali (EMP) totali e ad origine dal circolo sistemico, ma non quelle di origine polmonare, sono risultate significativamente più al- te nei pazienti di grado D (p=0,049 in entrambi i casi) rispetto al gruppo A-C [Figura 4.10, Capitolo 4]. Le microparticelle di derivazione monocitaria mo- strano, invece, solo una modestissima tendenza (p=0,085) ad avere livelli più alti nel gruppo D.

Le EMP totali correlano in modo diretto con i sintomi espressi dal punteggio CAT (p=0,042) [Figura 4.11, Capitolo 4], mentre le EMP di origine sistemica correlano sia con il punteggio CAT (p=0,042) sia con il grado di dispnea secon- do la scala mMRC (p=0,033) [Figura 4.12, Capitolo 4].

Per quanto riguarda la funzione respiratoria, c’è solo una certa tendenza ad una relazione inversa tra EMP totali e FEV1, così come tra EMP ad origine dal circolo polmonare e FEV1 (in entrambi i casi p=0,07). Si osservano, inoltre, una tendenza ad una relazione inversa tra EMP di origine polmonare e consumo di ossigeno al picco del test cardiopolmonare - in valore assoluto - (p=0,07), così come tra MP di origine monocitaria e consumo di ossigeno al picco del test cardiopolmonare - in percentuale del predetto - (p=0,053).

Dal confronto tra gruppi GOLD per i dati cardiovascolari [Figura 4.13, Capi- tolo 4] sono emerse due relazioni considerevoli. I pazienti in classe GOLD D presentano una frequenza cardiaca basale significativamente maggiore rispet- to al gruppo A-C (76 bpm contro 65 bpm, p=0,042). Vi è poi una forte tendenza (p=0,06) ad una differenza nella valutazione dell’eiezione ventricolare sinistra con Wave Intensity (1st-2nd): i soggetti in classe D GOLD, infatti, mostrano un tempo di eiezione tendenzialmente ridotto rispetto agli altri (240 ms contro

264 ms).

Infine, dall’analisi che ha messo a confronto i gruppi suddivisi secondo il FEV1 rispetto ad alcuni biomarcatori di flogosi [Figura 4.8, Capitolo 4] è risultata for- temente significativa (p=0,007) la differenza nei livelli di fibrinogeno tra i due gruppi: in particolare, questo indice di fase acuta mostra valori più elevati nei soggetti con funzione respiratoria meno compromessa (FEV1 ≥50%).

5.2

Uno sguardo alle microparticelle

Le vere protagoniste di questo studio meritano, a ragione, un’attenzione par- ticolare.

In letteratura non esistono, ad oggi e secondo le nostre conoscenze, studi che indaghino differenze in termini di microparticelle in soggetti con BPCO sud- divisi secondo i gruppi GOLD ABCD. Finora sono stati ipotizzati alcuni ruoli nell’ambito della BPCO per queste vescicole, ma che non spiegano appieno il loro significato biologico e soprattutto patogenetico. Le microparticelle di origine endoteliale sono state indicate come possibili markers di enfisema da Gordon nel 2011 [53] e da Thomashow nel 2013 [56]: in questi lavori, infatti, è stata identificata una relazione tra EMP ed entità dell’enfisema, valutata sia in termini di imaging con la TC del torace, che funzionali con la DLCO. Inol- tre, nel lavoro di Thomashow [56], le EMP mostravano anche una correlazione con il danno vascolare valutato mediante risonanza magnetica con mezzo di contrasto (gadolinio). Inoltre, gli studi del gruppo di Takahashi [54, 55], hanno proposto per le EMP un ruolo come marcatori di prognosi in termini di rischio di riacutizzazioni e di entità del declino della funzione respiratoria nel tempo. In questo senso, le EMP potrebbero rappresentare un futuro credibile marca- tore di gravità nella valutazione dei pazienti con BPCO.

Coerentemente con questi dati, la nostra osservazione, pur su un campione di soggetti limitato, ha permesso di individuare una significativa correlazione tra EMP totali e sistemiche e la gravità della BPCO valutata secondo il docu- mento GOLD 2011. I soggetti appartenenti al gruppo D (più sintomatici, con una più grave limitazione al flusso e/o con un numero di riacutizzazioni an- nue maggiore) hanno mostrato livelli circolanti di microparticelle endoteliali più elevati rispetto all’insieme dei soggetti appartenenti a ciascuno dei restanti gruppi (A+B+C). Come detto, a nostra conoscenza non esistono ad oggi lavori

pubblicati riguardanti i livelli di EMP nei pazienti BPCO, classificati secondo il sistema proposto dalle linee guida GOLD 2011, includente funzione respira- toria, sintomi e storia di riacutizzazioni.

Nella stessa direzione dei dati precedenti va anche il riscontro di una tenden- za, benché molto modesta, ad avere livelli di MP monocitarie più elevati nei soggetti con BPCO grave. Non solo: se si considerano i soggetti dal punto di vista dei sintomi, si evince che i più sintomatici in termini di punteggio CAT e di dispnea secondo la scala mMRC, sono ancora una volta, quelli con EMP totali e sistemiche più elevate.

Infine, anche il confronto tra funzione respiratoria, valutata con spirometria (FEV1), ed EMP fornisce risultati concordi con i precedenti, sebbene si tratti solo di una tendenza: le EMP, sia totali sia di origine polmonare, sono più nu- merose nel circolo sanguigno dei soggetti con una limitazione al flusso più gra- ve. Nella nostra casistica non abbiamo trovato, invece, una relazione tra EMP e tasso di riacutizzazioni. Ovviamente, rispetto ai lavori del gruppo di Taka- hashi, il nostro studio ha una natura trasversale, per cui non è stato possibile valutare il rapporto tra EMP ed andamento della funzione respiratoria; anche per quanto riguarda le riacutizzazioni, esse sono state valutate, nel nostro stu- dio, in modo retrospettivo, cioè in termini di storia pregressa, per cui risulta comunque difficile esprimere una considerazione valida sul rapporto tra EMP