3. MATERIALI E METODI
3.5 PROCEDURE EX VIVO
3.5.4 Analisi con Western Blot
Tramite la tecnica del Western Blot è possibile identificare delle proteine all’interno di un tessuto specifico e fare un’analisi semi-quantitativa di esse.
70 Quindi è stato deciso di usare questa metodica per analizzare il contenuto proteico degli ippocampi prelevati dagli animali lesionati con 192-IgG-sap nei nuclei colinergici del prosencefalo di base e/o inoculati con beta-amiloide 25-35. In particolare è stata indagata la presenza delle seguenti proteine: APP, TAU, TAU-P181 e TDP-43.
Qui di seguito viene riportato il procedimento che è stato utilizzato per la rilevazione degli antigeni e la quantificazione dei livelli di proteine.
3.5.4.1 PREPARAZIONE DEI TESSUTI
I frammenti di tessuto ippocampale, prelevati durante i sacrifici e conservati a-80°C, sono stati immersi in tampone RIPA (costituito da NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, NP-40 all’1%, SDS allo 0,1%, DOC allo 0,5% e EDTA 5Mm), a cui sono stati aggiunti degli inbitori delle proteasi, ed omogeneizzati mediante un omogeneizzatore (Ultra-Turrax). I campioni sono stati poi sonicati per 20 secondi ed infine centrifugati per 15min a 14000 rpm. Il surnatante che ne è risulatato è stato prelevato, posto in ghiaccio per 20 minuti ed il contenuto proteico è stato quantificato tramite NanoDrop (misurando l’assorbanza a 280 nm) per essere poi processato tramite immunoblotting.
3.5.4.2 SEPARZIONE DELLE PROTEINE MEDIANTE ELETTROFORESI SU SDS-PAGE
La separazione delle proteine è stata fatta tramite gel di poliacrilamide al 10% preparato in SDS (sodium dodecyl sulfate) 0,1%. Questo gel, posto in verticale, presenta una prima parte chiamata stacking gel dove la miscela proteica viene compattata, ed una seconda parte chiamata running o separating gel in cui avviene la separazione elettroforetica delle proteine in base al loro peso molecolare.Le aliquote utilizzate per il caricamento dei campioni sul gel, sono state preparate utilizzando un volume corrispondente a 20 mg di proteine a cui è stato aggiunto il buffer di caricamento (loading buffer) per ridurre i legami disolfuro.
I campioni così preparati sono stati denaturati in un blocco riscaldante a 100°C e poi caricati nei diversi pozzetti creati nel gel con un pettinino di plastica. Accanto ai campioni è stato caricato anche un apposito ladder, che costituendo una scala graduata, permette la detenzione del peso molecolare delle diverse proteine che vengono separate con questa tecnica.
La corsa su gel è stata effettuata applicando un campo elettrico e creando una differenza di potenziale di 35 V nella fase stacking del gel, e di 50 V in quella di separating. Le proteine in questo modo migrano dal polo negativo del gel a quello positivo, separandosi in base al loro peso molecolare.
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3.5.4.3 BLOTTING IN CAMERA DI TRASFERIMENTO
Dopo la corsa, i gel vengono posizionati nei transfer sandwiches, costituiti esternamente da supporti in plastica all’interno dei quali vengono posti in sequenza: un foglio di spugna, della carta da filtro 3 mm, il gel con le proteine separate, una membrana di nitrocellulosa, di nuovo della carta da filtro 3 mm ed un altro foglio di spugna. I transfer sandwiches così costituiti, vengono quindi immersi nel buffer di trasferimento che si trova dentro la camera di trasferimento che serve per il blotting. A questo punto, creando una differenza di potenziale le proteine (cariche negativamente) tendono a migrare verso il polo positivo, finchè non incontrano la membrana di nitrocellulosa che le blocca e le lega a sè.
3.5.4.4 RICONOSCIMENTO DEGLI ANTIGENI E SVILUPPO DELLE LASTRE
Le membrane che legano le proteine vengono recuperate ed incubate over-night in agitazione a RT in una soluzione di bloking contenente PBS1X, BSA al 3%, TWEEN allo 0,1% ed inibitori delle fosfatasi, per bloccare i siti di legami aspecifici a cui potrebbero legarsi gli anticorpi e per evitare la perdita dei gruppi fosfato associati alle proteine d’interesse. In seguito le membrane vengono esposte per un’ora all’azione dell’anticorpo primario (Tab. 3.2) opportunamente diluito in PBS1X, BSA al 3% e TWEEN allo 0,1%. Poi vengono effettuati tre lavaggi di 5 min ciascuno con PBS1X e TWEEN 0,5% e le membrane vengono messe ad incubare per un’ora con un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi del rafano (HRP) (Tab. 3.2) e diluito in PBS1X, BSA al 3% e TWEEN allo 0,1%. Alla fine di questa incubazione le membrane vengono lavate ancore tre volte con PBS1X e TWEEN 0,5% ed infine solo con PBS1X.
A questo punto è possibile visualizzare gli antigeni d’interesse tramite un substrato luminescente: il luminolo, che viene ossidato in condizioni alcaline dalla perossidasi del rafano. Le membrane infatti vengono esposte per 3 minuti ad una soluzione contenente il luminolo (Pierce ECL Western Blotting Substrate – Thermo Scientific), che crea una reazione di chemioluminescenza. Questa, in stanza oscura (dove tutto viene fatto rigorosamente al buio), viene impressa su delle lastre fotografiche (Kodak) con dei tempi d’esposizione variabili. Le lastre vengono poi immerse in una soluzione di sviluppo e poi in una di fissaggio per permetterne lo sviluppo e la detenzione delle bande proteiche.
72 ANTIGENE ANTICORPO PRIMARIO ANTICORPO SECONDARIO APP ms anti-APP [1:200] HRP anti-ms [1:2000] TAU ms anti-TAU [1:100] HRP anti-ms [1:2000] TAU-P181Thr ms anti-TAU-P181Thr [1:100] HRP anti-ms [1:2000] TDP-43 rb anti-TDP-43 [1:1000] HRP ant-rb [1:2000] beta-tubulina ms anti-beta-tubulina [1:10000] HRP anti-ms [1:2000]
Tab. 3.2: In tabella sono indicati gli anticorpi primari e secondari utilizzati per l’immunoblotting e le rispettive diluizioni di lavoro. La beta-tubulina è una proteina house-keeping che viene utilizzata come
controllo.
3.5.4.5 ANALISI DENSITOMETRICHE
Le lastre fotografiche ottenute dai Western Blot sono state scannerizzate (SNAPSCAN 1212u, Agfa) per poi poter valutare la densità delle bande proteiche tramite analisi densitometrica computerizzata (effettuata tramite ImageJ).