Analisi dei dati delle colture cellulari

Negli esperimenti riguardanti la valutazione dell’iperpolarizzazione e il rilascio dell’H2S, la fluorescenza è stata misurata ad una lunghezza d’onda di eccitazione di

450 nm e di emissione di 520 nm mediante il lettore multipiastra EnSpire (Perkin Elmer©). Inoltre ad ogni dato registrato sia per le cellule trattate con BW che per quelle trattate con la sostanza di riferimento o esposte solo al veicolo è stato sottratto il valore dei corrispettivi ‘bianchi’, ovvero la fluorescenza registrata nei pozzetti contenenti i medesimi trattamenti ma privi di cellule. Nell’esperimento con la sonda DiBac(4)3, i valori acquisiti sono stati espressi come variazione di fluorescenza, calcolata con la seguente formula:

ΔF= (Ft – F0) /F0

Dove F0 è la fluorescenza di base prima dell’aggiunta dell’agente iperpolarizzante

mentre Ft è la fluorescenza al tempo t dopo l’aggiunta dell’agente iperpolarizzante. I grafici così ottenuti sono stati poi rielaborati al fine di calcolare l’area sotto la curva (AUC) e infine i dati di tutti i composti in esame sono stati espressi come AUC percentuale rispetto al valore di AUC del composto iperpolarizzante di riferimento

48 NS1619 alla concentrazione di 10μM. Nel caso degli esperimenti con la sonda WSP- 1 le differenti quantità di H2S rilasciato dai composti sono state espresse come

indice di fluorescenza (FI) e le diverse AUC sono state messe a confronto con i valori del veicolo. L’elaborazione e l’analisi dei dati sono state effettuate mediante l’impiego del software Graph Pad Prism 6.0. L’analisi statistica è stata condotta mediante test statistico t di Student; un livello di p<0.05 è stato considerato come limite di significatività statistica (*p<0.05; **p<0.01; *** p<0.001).

Negli esperimenti con WST-1, l’assorbanza è stata misurata a 450nm mediante il lettore multipiastra EnSpire (Perkin Elmer©). La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale di assorbanza esibita dalle cellule sottoposte a insulto ossidativo tramite H2O2 o sottoposte a danno infiammatorio da High-Glucose rispetto alle

cellule in presenza di solo veicolo. I valori sono poi stati espressi come media ± errore standard. L’analisi statistica è stata condotta mediante test statistico t di Student; un livello di p<0.05 è stato considerato come limite di significatività statistica (*p<0.05; **p<0.01; *** p<0.001).

49 Il composto di nuova sintesi BW è stato dapprima studiato per le sue capacità di entrare all’interno delle cellule HASMC e di rilasciare H2S. In questo protocollo il

DADS, alla concentrazione di 100µM, è stato selezionato come composto di riferimento in quanto noto H2S-donor di origine naturale che in studi precedenti ha

mostrato la capacità di rilasciare H2S a livello intracellulare con una cinetica lenta e

graduale; tale cinetica è quella auspicabile per un H2S-donor che si voglia applicare

nella terapia di patologie cardio-vascolari come fonte esogena in grado di colmare l’eventuale mancanza di H2S endogeno.

In questo set di esperimenti il composto BW è stato testato a tre concentrazioni e la sua cinetica di rilascio dell’H2S è stata osservata per 50 minuti fino al

raggiungimento di un plateau.

La quantità di H2S rilasciata da BW e DADS all’interno delle cellule HASMC è stata

misurata attraverso un indice di fluorescenza (FI) ed espressa come area sotto la curva (AUC) dell’incremento di fluorescenza nell’arco dei 50 minuti di osservazione (Grafico 1).

Il composto BW ha esibito una capacità di rilasciare H2S concentrazione-dipendente

(AUC del FI di BW 30µM: 73703 ± 9732, di BW 100µM: 114550 ± 10187, di BW 300µM: 169482 ± 5554) che è risultata statisticamente significativa per tutte le concentrazioni testate, ma che ha raggiunto livelli paragonabili a quelli evocati da DADS 100µM (AUC del FI di DADS 100µM: 188059 ± 11997) solo alla concentrazione massima di BW 300µM (Grafico 2).

50 10 20 30 40 50 0 3000 6000 9000 Veicolo 1% DMSO DADS 100M BW 300M BW 100M BW 30M minuti In d ic e d i fl u o re s c e n z a d e l ri la s c io d i H2 S ( F I)

Grafico 1: Variazione della fluorescenza emessa nel tempo dalla sonda WSP-1 a seguito del rilascio di H2S intracellulare dopo trattamento delle cellule HASMC con veicolo (1% di DMSO), con DADS 100µM, con BW 30µM, con BW 100µM e con BW 300µM (curva blu scuro). Le barre verticali indicano l’errore standard.

Vei colo 1% DM SO M DA DS 100 M  BW 30 M  BW 10 0 M BW 30 0 0 50000 100000 150000 200000 250000

*

*

*

*

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_**

*

*

*

A UC d e l ri la s c io d i H2 S ( F I)

51

Grafico 2: Area sotto la curva della variazione della fluorescenza emessa nel tempo (50min) dalla sonda WSP-1 su cellule HASMC trattate con veicolo (1% DMSO), con DADS 100µM, con BW 30µM, con BW 100µM e con BW 300µM. Le barre verticali indicano l’errore standard mentre gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di rilascio del solfuro di idrogeno significativamente differente da quello del corrispondente veicolo (**p<0,01; ***p<0,001).

Dopo aver dimostrato le capacità H2S-donor del composto di nuova sintesi BW, il

lavoro di tesi si è concentrato sulla valutazione delle proprietà iperpolarizzanti di membrana su cellule HASMC come parametro prodromico all’effetto vasorilasciante. Tale parametro, misurato attraverso la diversa fluorescenza emessa dalla sonda DiBac4(3) a seguito di variazioni del potenziale di membrana, è stato confrontato con l’azione evocata da un composto iperpolarizzante di riferimento, ovvero NS1619 10µM già utilizzato in studi precedenti [Martelli A. et al. 2014]. La capacità del composto BW di iperpolarizzare la membrana delle HASMC è stata monitorata per circa 40 minuti (Grafico 3) e successivamente espressa come percentuale dell’area sotto la curva rispetto al valore evocato da NS1619.

Il composto BW ha indotto un’azione iperpolarizzante chiaramente concentrazione-dipendente e statisticamente significativa alle tre concentrazioni testate (AUC % dell’effetto iperpolarizzante rispetto a NS1619 di BW 30µM: 48 ± 3, di BW 100µM: 90 ± 5, di BW 300µM: 163 ± 6) raggiungendo addirittura valori superiori a quelli evocati da NS1619 10µM alla concentrazione di 300µM (Grafico

52 0 10 20 30 40 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 NS1619 10M BW 300M BW 100M BW 30M min F t- F 0 /F 0

Grafico 3: il grafico che mostra la variazione di fluorescenza rilevata nel tempo, correlata all’effetto iperpolarizzante di membrana sulle cellule HASMC in seguito a trattamento con NS1619 10µM (composto iperpolarizzante di membrana di riferimento), BW 30µM, BW 100µM e BW 300µM. Le barre verticali indicano l’errore standard.

M  NS 1619 10 M  BW 30 M  BW 10 0 M BW 30 0 0 50 100 150 200

*

*

*

**

*

*

*

*

*

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*

A UC % e ff e tt o i p e rp o la ri z z a n te

53

Grafico 4: Area sotto la curva (AUC) del grafico relativo all’effetto iperpolarizzante di membrana sulle cellule HASMC in seguito al trattamento con NS1619 10µM, BW 30µM, BW 100µM e BW 300µM. L’effetto iperpolarizzante di membrana di NS1619 è posto come 100%. Le barre verticali mostrano l’errore standard. Gli asterischi (*) indicano un valore significativamente differente rispetto al veicolo con ***p<0,001.

Tra le concentrazioni testate è stata quindi selezionata la 30µM come concentrazione in grado di evocare circa il 50% dell’effetto iperpolarizzante di NS1619. L’iperpolarizzazione indotta da BW 30µM è stata quindi investigata anche in presenza di tre diversi bloccanti dei canali del potassio quali XE991 10µM (bloccante dei canali Kv7), glibenclamide 10µM (bloccante dei canali KATP) e

iberiotossina 100nM (bloccante dei canali BKCa).

Tale valutazione è sembrata interessante poiché dati di letteratura hanno dimostrato che H2S è in grado di iperpolarizzare la membrana attraverso

l’attivazione di alcuni sottotipi dei canali del potassio (Martelli A. et al. 2013) e in particolare è stato dimostrato che quelli maggiormente coinvolti sono i canali KATP

e Kv7.

I risultati di questo lavoro di tesi dimostrano che l’azione iperpolarizzante data dal composto BW viene antagonizzata in maniera significativa dal bloccante dei canali Kv7, XE991 (AUC % dell’effetto iperpolarizzante rispetto a NS1619 33 ± 4) e in maniera evidente seppur non statisticamente significativa dal bloccante dei canali KATP, glibenclamide (AUC % dell’effetto iperpolarizzante rispetto a NS1619 37 ± 6)

a conferma del coinvolgimento di H2S nell’azione iperpolarizzante indotta da BW

54 0 10 20 30 40 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 NS1619 10M BW 30M BW 30M +XE991 10M BW 30M +GLI 10M BW 30M +IbTx 100 nM min F t- F 0 /F 0

Grafico 5: Grafico che mostra la variazione di fluorescenza rilevata nel tempo, correlata all’effetto iperpolarizzante di membrana sulle cellule HASMC in seguito a trattamento con solo BW 30µM, con NS1619 10µM e con BW 30µM in presenza di XE991 10µM, glibenclamide 10µM, iberiotossina 100nM. Le barre verticali indicano l’errore standard.

M  BW 30 M  M + XE99 1 10  BW 30 M  M + GLI 10  BW 30 M + IbTx 100 nM  BW 30 0 25 50 75 100

*

A UC % e ff e tt o i p e rp o la ri z z a n te v s NS 1 6 1 9

55

Grafico 6: AUC % del grafico relativo all’attività iperpolarizzante di BW 30µM vs NS1619, in assenza e in presenza di XE991 10µM, glibenclamide 10µM o iberiotossina 100nM. Le barre verticali indicano l’errore standard. Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di iperpolarizzazione della membrana significativamente differente da quello di BW 30µM (*p<0,05).

In questo lavoro di tesi sono stati inoltre acquisiti dati preliminari riguardanti l’azione vasoprotettiva esplicata da BW, in quanto H2S-donor, nei confronti di un

danno di tipo ossidativo e di un danno di tipo infiammatorio.

Per quanto riguarda l’azione protettiva nei confronti del danno ossidativo indotto mediante somministrazione di H2O2 200µM a cellule HASMC, le tre concentrazioni

di composto testate (BW 3µM, 10µM e 30µM) sebbene abbiano mostrato una tendenza alla protezione nei confronti di tale insulto, non hanno raggiunto il limite di significatività statistica (% di vitalità cellulare H2O2 200µM 80 ± 4, % di vitalità

cellulare H2O2 + BW3µM 102 ± 11, % di vitalità cellulare H2O2 + BW 10µM 94 ± 5,

56 Vei colo 1% DM SO M 200 2 O 2 H M  M +B W 3  200 2 O 2 H M  M + BW 10  200 2 O 2 H M  M +B W 3 0  200 2 O 2 H 0 25 50 75 100 125

*

*

% V ita lit à ce llu la re

Grafico 7: Grafico relativo alla vitalità cellulare delle cellule HASMC trattate con solo veicolo (1% DMSO) o cono solo H2O2 200µM (2h) o trattate con H2O2 200µM

e BW a diverse concentrazioni 3µM, 10µM e 30µM. Le barre verticali indicano l’errore standard. Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di vitalità significativamente differente da quello del veicolo (**p<0,01).

Per quanto riguarda invece il modello di infiammazione vascolare indotto attraverso livelli elevati di glucosio in assenza di siero (HG-S= High Glucose - Serum Free), sebbene il dato sia preliminare, risulta evidente come tutte e tre le concentrazioni (3µM, 10µM e 30µM) del composto BW siano state in grado di proteggere le cellule di muscolatura liscia vascolare in maniera significativa rispetto al danno indotto (% di vitalità cellulare HG-S: 65 ± 5, % di vitalità cellulare HG-S + BW 3µM: 100 ± 7, % di vitalità cellulare HG-S + BW 10µM: 97 ± 5, % di vitalità cellulare HG-S + BW 30µM: 100 ± 8) (Grafico 8).

57 Vei colo 1% DM SO HG -S 2 5m M _M HG -S 2 5m M + BW 3 M  HG -S 2 5m M + BW 10 M  HG -S 2 5m M + BW 30 0 25 50 75 100 125

**

_*

*

§ § % V it a li tà c e ll u la re

Grafico 8: Grafico relativo alla vitalità cellulare delle cellule HASMC trattate con solo veicolo (1% DMSO) o con HG-S 25mM (72h) o trattate con HG-S 25mM e BW a diverse concentrazioni 3µM, 10µM e 30µM. Le barre verticali indicano l’errore standard. Gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di vitalità significativamente differente da quello del danno da HG-S 25mM (*p<0,05). Il simbolo § indica un valore significativamente differente rispetto al veicolo (§§p<0,01).

In conclusione il composto di nuova sintesi BW si è rivelato a tutti gli effetti un H2S-donor in grado di penetrare la membrana delle cellule HASMC e di donare H2S

all’interno di tali cellule. Inoltre BW ha esibito anche azioni vascolari tipiche del gastrasmettirore endogeno H2S, quali l’iperpolarizzazione di membrana in cellule

58 muscolari vascolari ed inoltre tale azione è risultata dipendente dall’attivazione di canali del potassio che rappresentano un noto meccanismo d’azione tipico dell’azione vasorilasciante di H2S.

Infine BW ha mostrato di possedere ulteriori caratteristiche benefiche a livello vascolare sovrapponibili a quelle del gastrasmettitore H2S, esibendo effetti

protettivi nei confronti del danno ossidativo e in maniera ancora più chiara nei confronti del danno vascolare di tipo infiammatorio.

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