Effetti vascolari di un nuovo H2S-donor su cellule di muscolatura liscia di aorta umana (HASMC)

Università di Pisa

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Farmacia

TESI DI LAUREA

EFFETTI VASCOLARI DI UN NUOVO H

S-DONOR SU CELLULE

DI MUSCOLATURA LISCIA DI AORTA UMANA (HASMC)

Relatori:

PROF. VINCENZO CALDERONE DOTT.SSA ALMA MARTELLI

Correlatore: Candidata DOTT.SSA VALENTINA CITI ELISA RITACCO

1

INDICE

Capitolo 1

1.INTRODUZIONE

………..

3

1.1 IL SOLFURO D’IDROGENO………..…3

1.1.1 Proprietà chimiche e biosintesi dell’H

S………3

1.1.2 Catabolismo………..………9

1.2 RUOLO DI H

S A LIVELLO VASCOLARE………...11

1.2.1 Azione vascolare funzionale……….11

1.2.2 Ruolo protettivo a livello vascolare……….16

1.2.2.1 Protezione di H

S da danno ossidativo (H

O

)………...16

1.2.2.2 Protezione di H

S da danno infiammatorio (High-

glucose)………21

Capitolo 2

2.SCOPO DELLA RICERCA………..25

Capitolo 3

3.MATERIALI E METODI……….26

3.1 Materiali e metodi per la sperimentazione in vitro su cellule

HASMC………..26

2

3.1.1 Colture cellulari………..26

3.1.2 Mezzo di coltura………27

3.1.3 Soluzioni tampone utilizzate durante i protocolli

sperimentali……… 28

3.1.4 Gelatina………...29

3.1.5 Sostanze utilizzate durante i protocolli sperimentali e loro

soluzioni………..30

3.1.6 Protocollo sperimentale………34

3.1.6.1 Scongelamento……….34

3.1.6.2 Piastratura………35

3.1.6.3 Esperimenti in fluorescenza………38

3.1.6.3.1 Esperimenti con sonda DiBac4(3)……… ………..39

3.1.6.3.2 Esperimenti con sonda fluorescente WSP-1………41

3.1.6.3.3 Esperimenti con WST-1………..43

3.1.6.3.3.1 Esperimento per valutare l’effetto protettivo di BW

nei confronti del danno ossidativo………44

3.1.6.3.3.2 Esperimento per valutare l’effetto protettivo di BW

nei confronti del danno da High-glucose……….45

3.1.7 Analisi dei dati delle colture cellulari………..46

Capitolo 4

4.RISULTATI E DISCUSSIONE………48

BIBLIOGRAFIA………..58

3

1. INTRODUZIONE

1.1 Il solfuro di idrogeno

Per molto tempo il solfuro di idrogeno (H2S) è stato descritto solo come gas tossico

che inibisce la catena respiratoria mitocondriale, ma questo suo ruolo è stato recentemente rivisto in quanto diversi studi hanno dimostrato che l’H2S è generato

a livello endogeno ed è fisiologicamente presente nel sangue e in diversi distretti dell’organismo dove svolge numerose azioni atte a preservare l’omeostasi del sistema cardiovascolare, respiratorio, gastroenterico e nervoso [Wang R. 2012; Calderone V. et al. 2016].

È stato dimostrato inoltre che H2S ha un ruolo fisiologico nella inibizione

dell’adesione e dell’attivazione neutrofila [Kimura Y. et al. 2010; Szabò C. 2007; Wang R. 2003].

1.1.1 Proprietà chimiche e biosintesi dell’H

S:

In soluzione acquosa H2S, essendo un acido debole, si dissocia in H+ e HS- (anione

idrosolfuro) che a sua volta può dissociarsi in H+ _{e S}2- _{(anione solfuro) in accordo}

4 H2S ⇆ H+ + HS- ⇆ 2H++ S2-

A pH e a temperatura fisiologici circa il 20% del solfuro totale esiste come acido indissociato e l’80% come anione HS- _{, come teoricamente previsto dall’equazione}

di Henderson-Hasselbach [Dorman DC. et al. 2002; Dombkowski RA. et al. 2004; Hughes MN. et al 2009]. Così in condizioni fisiologiche, percentuali significative di H2S e HS- coesistono ed entrambe le specie contribuiscono direttamente all’azione

biologica dell’ H2S.

Al contrario i livelli della specie ionica S2- _{sono insignificanti poiché una}

dissociazione apprezzabile dell’HS- _{richiede un valore di pH più alto di quello}

fisiologico. Grazie alla sua elevata lipofilicità, H2S attraversa liberamente le

membrane biologiche e penetra in tutti i tipi di cellule; questa proprietà conferisce ad H2S un alto potenziale biologico [Li L. et al. 2008]. HS-, che è la specie prevalente,

agisce come nucleofilo e si lega al centro metallico delle molecole biologiche, come ad esempio il sito di legame dell’ossigeno nell’emoglobina. Questa caratteristica chimica, insieme ad altre caratteristiche metaboliche, potrebbe portare ad un sostanziale aumento della concentrazione di solfuro nell’organismo [Hughes MN. et al. 2009].

L’ H2S endogeno può esser prodotto nelle cellule eucariote dei mammiferi sia

attraverso una via biosintetica enzimatica che una non enzimatica.

La via non enzimatica, sebbene meno importante , procede attraverso la riduzione dello zolfo elementare ad H2S con la contemporanea ossidazione di due molecole

5 di glucosio. Il lattato è il principale prodotto del metabolismo del glucosio come riassunto nella seguente reazione:

2C6H12O6

+

6S

_{+3H2O  3C3H6O3}

₊

_6H

2

S

+ 3CO2

Sebbene il glucosio supporti la produzione di H2S , altri substrati sono altrettanto

efficienti. Per esempio i trasportatori di elettroni NADH, NADPH e glutatione ridotto (GSH) sono coinvolti in questo processo in quanto stimolano la produzione di H2S

nei lisati cellulari degli eritrociti umani. Probabilmente il GSH è direttamente responsabile della maggior parte della produzione di H2S.

A sua volta il risultante glutatione ossidato (GSSG) è ridotto dal NAD(P)H e usato di nuovo [Wang R. 2002; Searcy DG. et al 1998].

La produzione enzimatica di H2S è assicurata principalmente da due enzimi 2

piridossale 5’ fosfato dipendenti: la β-sintetasi (CBS) e la cistationina-γ-liasi (CSE) i quali hanno come substrato l’amminoacido L-cisteina [Chen X. et al. 2004]. Un’ulteriore via enzimatica di produzione di H2S è effettuata tramite la

cooperazione di due enzimi: cisteina aminotransferasi (CAT) e 3-mercaptopiruvato sulfotransferasi (3-MST) [Stipanuk MH. 2004; Mikami Y. et al. 2011; Ishigami M. et al 2009].

CBS e CSE sono ampiamente espresse nei tessuti dei mammiferi, ma la loro distribuzione non è omogenea [Kamoun P. 2004]. Per esempio la CBS si ritiene che sia espressa in modo predominante nel sistema nervoso centrale e generalmente

6 assente nei tessuti vascolari dove potrebbe essere indotta solamente in particolari condizioni [Robert K. et al. 2003].

Al contrario la CSE è ritenuta la principale fonte di H2S nel sistema cardiovascolare

dove la quantità di H2S prodotta da tale enzima si stima che rientri nel range di 3-6

nanomoli/min/g di tessuto [Ishii I. et al. 2004]. Sebbene originariamente si ritenesse che la CSE fosse espressa nelle cellule della muscolatura liscia vascolare, ma non nelle cellule endoteliali [Zhao W. et al 2001, Wang R. 2003], recenti studi immunoistochimici hanno proposto che la CSE sia localizzata principalmente a livello delle cellule endoteliali, mentre sembra essere poco espressa nelle cellule della muscolatura liscia vascolare. Inoltre la delezione genica della CSE causa una diminuzione significativa della concentrazione di H2S nel sangue e negli organi del

sistema cardiovascolare dei topi, che è accompagnata da ipertensione e ridotta risposta vasorilasciante [Yang G. et al. 2008].

Nella prima via biosintetica, la CBS idrolizza la L-Cisteina formando una quantità equimolare di L-Serina e solfuro di idrogeno (Schema 1) [Porter P. et al. 1974]. Nella seconda via biosintetica due molecole di Cisteina reagiscono per formare L-Cistina (dimero di L-Cisteina), che si scinde in tiocisteina, piruvato ed ammoniaca attraverso una reazione CSE mediata (Schema 2). A sua volta la tiocisteina può essere sottoposta a due diversi processi:

• uno non enzimatico, dando come risultato la formazione di L-Cisteina e H2S

7 • l’altro è una reazione CSE dipendente con un composto tiolico R-SH (come cisteina o glutatione) dando come prodotti H2S e CysS-R [Stipanuk MH. et al 1982;

Yamanishi T. et al 1981].

Schema 1: Biosintesi di H2S da parte di CBS.

Schema 2: Principale via biosintetica di H2S da parte di CSE.

La terza via coinvolge la partecipazione dell’enzima cisteina aminotransferasi (CAT) che catalizza la reazione tra L-Cisteina e α-Chetoglutarato portando alla formazione di 3-Mercaptopiruvato ed L-Glutammato; il primo composto può essere così

8 desolforato dalla 3-mercaptopiruvato solfo transferasi (MPST) per dare piruvato e solfuro di idrogeno [Kuo SM. et al. 1983; Shibuya N. et al. 2009]. In alternativa quando gli ioni solfito (SO32-) sono disponibili, il 3- mercapto piruvato può essere

convertito a piruvato e tiosolfato (S2O32- ) che a sua volta può reagire col glutatione

ridotto (GSH) e produrre H2S, H2SO3 e glutatione ossidato (GSSG). (Schema 3)

Schema 3: Biosintesi di H2S da parte di CAT e 3-MST.

Nella quarta via biosintetica la L-Cisteina ed il solfito sono convertiti ad L-Cisteato e H2S dalla cisteina liasi [Li L. et al. 2009].

9 Schema 4: Sintesi di H2S da parte della cisteina liasi.

Alcuni fattori endogeni ed esogeni possono influenzare l’attività della CBS e della CSE. Nel cervello l’attività della CBS è regolata dal Ca2+ _{e dalla calmodulina; inoltre}

la produzione di H2S CBS-dipendente è aumentata da fattori che portano ad una

crescita del Ca2+ _{intracellulare, come gli agonisti glutammatergici che attivano i}

recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) ed i recettori α-amino-3-idrossi-5-metil-4- isossazolopropionato (AMPA). Al contrario si pensa che l’NO inattivi la CBS. Al riguardo, il paradossale incremento dell’attività della CBS promossa in vitro dal sodio nitroprussiato, donatore di NO, è indipendente dalla sua capacità di rilasciare NO ed è stato spiegato da una diretta modificazione della CBS [Eto K. et al. 2002A; Eto K. et al. 2002B; Taoka S. et al. 2001]. Quando consideriamo il sistema cardiovascolare, la generazione di H2S CSE-mediata è aumentata dal donatore di

NO in un modo cGMP dipendente. In parallelo è stato scoperto che gli inibitori della NO-sintasi riducono la produzione di H2S [Zhao W. et al. 2003].

1.1.2

Catabolismo

In riferimento alla via responsabile della degradazione dell’H2S, si deve tener

presente che H2S è un’importante specie riducente che può essere facilmente

consumata da una varietà di agenti ossidanti [Whiteman M. et al. 2004; Whiteman M. et al. 2005; Chang L. et al. 2008; Geng B. et al. 2004B]. Un’altra via importante del catabolismo di H2S, probabilmente la principale, si realizza nei mitocondri. In

10 particolare, è stato recentemente osservato che nel fegato di ratto i mitocondri possono efficientemente ossidare H2S con un consumo di ossigeno circa quattro

volte minore di quello osservato per l’ossidazione del substrato fisiologico succinato. Questo processo ossidativo è prevenuto dagli inibitori dei complessi III e IV della catena respiratoria, ovvero mixotiazolo e cianuro. Il meccanismo d’ossidazione procede attraverso alcuni step enzimatici, mediati dalla chinone ossidoreduttasi, dalla S-diossigenasi, e dalla S-transferasi portando alla formazione di tiosolfato. Il tiosolfato è così biotrasformato, dalla rodanasi, in solfito (questa reazione richiede anche la presenza di cianuro, che è convertito in tiocianato) il quale a sua volta viene ossidato a solfato dalla solfito ossidasi (SO) [Goubern M. et al. 2007; Hildebrandt TM. et al. 2008].

Sebbene il solfato inorganico sia il predominante prodotto finale stabile del catabolismo dell’ H2S, non può essere considerato come un biomarcatore affidabile

per un’accurata stima quantitativa della produzione di H2S nel sangue dei

mammiferi. Infatti gli ioni solfato possono essere generati anche in altri modi, come la diretta ossidazione della cisteina da parte della cisteina diossigenasi o dalla ossidazione dei solfiti prodotti da altre fonti [Li L. et al. 2009]. In più, a causa della natura chimica di H2S, l’ordine micromolare di grandezza delle sue concentrazioni

plasmatiche, che sono spesso riportate in letteratura, riflette la somma delle specie non dissociate di H2S e degli ioni non dissociati: HS- (che è la specie più abbondante

a pH fisiologico) e l’anione solfuro S2- _{(la cui presenza è trascurabile a pH fisiologico)}

11 Son noti anche altri meccanismi, relazionati al catabolismo di H2S. La

solfoemoglobina, risultante dalla reazione tra H2S e metaemoglobina, può esser

vista come un possibile biomarcatore dell’ H2S plasmatico [Kurzban GP. et al. 1999].

Una via alternativa in più, che opera solamente nel citosol cellulare e coinvolge quantità minori di H2S, è la metilazione dell’H2S da parte del tiolo S-metiltransferasi

che forma metantiolo e dimetilsolfuro [Furne J. et al. 2001]. Sono state trovate anche altre vie ossidative minori dell’H2S a solfito, per esempio nell’attivazione

neutrofila [Mitsuhashi H. et al. 2005].

1.2 RUOLO DI H

S A LIVELLO VASCOLARE

1.2.1 Azione vascolare funzionale

H2S agisce come gastrasmettitore endogeno dalle caratteristiche poliedriche, influenzando quasi tutte le funzioni dell’organismo [Wang R. 2012; Martelli A. et al 2012]. In particolare, è un regolatore cardine dell'omeostasi a livello del sistema cardiovascolare [Bucci M. et al. 2011; Li L. et al. 2009; Yang G. et al. 2015], dove promuove effetti rilascianti sulla muscolatura liscia [Cheng Y. 2004].

Le cellule muscolari lisce vascolari, che costituiscono la maggior parte della parete vasale, attraverso le loro caratteristiche altamente plastiche e dinamiche e grazie alla capacità di sottoporsi a differenziazione fenotipica, sono coinvolte in processi di cambiamento costituiti da disfunzione endoteliale, aumento della contrazione vascolare e rimodellamento arterioso, caratteristici dell’ipertensione. [Savoia C. et al. 2011; Intengan HD. et al. 2000; Montezano AC. et al. 2015].

12 Gli stimoli pro-ipertensivi, come l'attivazione del sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS), lo stress ossidativo, l'attivazione del sistema nervoso simpatico, i cambiamenti emodinamici e le forze meccaniche, stimolano la segnalazione vascolare della muscolatura liscia, che promuove così la vasocostrizione, l’ipertrofia vascolare, la fibrosi, l’infiammazione e la calcificazione, processi che sono alla base dei cambiamenti vascolari funzionali, strutturali e meccanici nell'ipertensione. [Touyz RM. et al. 2000; Endemann DH. et al. 2004].

L’azione vasorilasciante indotta da H2S è stata osservata per la prima volta da Hosoki et al. (1997) su tessuti di vena porta e aorta toracica di ratto in vitro, mentre successivamente Zhao et al. (2001) hanno dimostrato che il processo di vasodilatazione H2S-indotto, è un meccanismo dose-dipendente ed avviene attraverso l'apertura dei canali KATP.

Questi effetti vasoattivi di H2S derivano da esperimenti condotti sia in vivo, monitorando il cambiamento della pressione sanguigna dei ratti, sia in vitro misurando lo sviluppo della tensione vascolare e le correnti dei canali del K+ _in

cellule isolate di muscolatura liscia vascolare.

In questi esperimenti è stato dimostrato che il pinacidil, attivatore dei canali KATP, promuove effetti sovrapponibili a quelli indotti dalla somministrazione di H2S; al contrario la glibenclamide, inibitore dei canali KATP, blocca il rilasciamento indotto dal gastrasmettitore. [Zhao WM. 2001; Cheng Y. 2004].

Questo studio ha anche dimostrato che il vasorilasciamento indotto da H2S è attenuato dalla rimozione dell'endotelio o dall'incubazione dell’ estere metilico

Nω-13 nitro-L-arginina (L-NAME , un inibitore della NO-sintasi) in presenza dell'endotelio. Questo effetto potrebbe essere spiegato dal rilascio di fattori vasorilascianti derivati dall'endotelio in risposta alla stimolazione di H2S [Zhao WM. 2001; Cheng, Y. 2004].

L'ossido nitrico (NO) è certamente fondamentale per l’attività di vasorilasciamento che si esplica attraverso il rilascio di fattori derivati dall'endotelio all'interno della parete del vaso [Moncada S. et al 1991]. Infatti in seguito a stimolazione muscarinica, NO viene prodotto dalla conversione della L-arginina mediante ossido

nitrico sintasi endoteliale (eNOS), diffonde dall'endotelio allo strato sottostante della muscolatura liscia, dove stimola la guanilato ciclasi a produrre cGMP. Quest’ultimo, a sua volta, attiva la protein chinasi G (PKG), che avvia una cascata di eventi che portano al rilasciamento vasale. [Ignarro L. et al 1999; Hofmann F2004].

Le cellule endoteliali vascolari esprimono anche la cistationina γ-liasi (CSE) e perciò assicurano la produzione di H2S, che esibisce così un’attività di fattore rilasciante

derivata dall'endotelio [Yang G et al. 2008]. Quindi la stimolazione muscarinica porta anche all'attivazione della CSE endoteliale, enzima dipendente dal sistema calcio/ calmodulina come per la eNOS dimostrando pertanto, che all'interno della parete vascolare, queste 2 vie coesistono e svolgono una funzione simile [Bucci M. et al 2010]. A questo livello, di fondamentale importanza è però la stimolazione di eNOS tramite l’attivazione della via di trasduzione del segnale PI3K/Akt da parte di H2S, che porta alla fosforilazione di eNOS, aumentando di conseguenza l’attività

14 Schema 5: Processo di vasorilasciamento vascolare.

Inoltre è stato dimostrato che H2S svolge un ruolo importante di vasorilasciamento

anche tramite l'inibizione della fosfodiesterasi di tipo 5 vascolare, con conseguente riduzione della degradazione del cGMP nelle cellule muscolari lisce vascolari [ Bucci M. et al.2010].

Per verificare che l'aumento di cGMP in seguito all’esposizione di H2S fosse dovuto

all'inibizione della sua degradazione, è stato utilizzato l'inibitore non selettivo per le PDE, IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), osservando che H2S ha causato un

aumento dei livelli di cGMP di entità simile a IBMX.

Successivamente utilizzando un sistema di sovraespressione è stato dimostrato che H2S inibisce la PDE5 ampiamente distribuita nel sistema

15 tessuto renale della scimmia verde africana, Cercopithecus aethiops ) con H2S

esogeno (tramite somministrazione di NaHS) si è osservato l’aumento dei livelli di cGMP, probabilmente a causa dell'inibizione delle PDE espresse endogenamente dalle cellule. Infine, per ottenere prove dirette dell'inibizione, è stata usata una miscela di isoforme di PDE semipurificate in un test privo di cellule disponibile in commercio. I risultati di questi esperimenti hanno confermato che H2S è un

inibitore non selettivo dell'attività della PDE. [Bucci M. et al. 2010]. Oltre ai meccanismi di inibizione della PDE5 e di stimolazione della eNOS, il meccanismo principale di vasodilatazione H2S-indotta, passa attraverso l’apertura dei canali KATP [Zhao W. et al. 2001].

Più recentemente è stata anche definita l’azione di H2S come attivatore dei canali

del potassio voltaggio-dipendenti Kv7, inizialmente mediante studi funzionali su vasi di roditori [Schleifenbaum J 2010] e poi definitivamente attraverso approcci funzionali che prevedevano esperimenti ex vivo su anelli di aorta di ratto privati dell’endotelio, nei quali è stato dimostrato che bloccanti selettivi di questi canali, come XE991 sono in grado di ridurre drasticamente la dilatazione H2S-indotta

[Martelli A. et al. 2013].

Il solfuro d’idrogeno va inoltre ad agire sui canali del potassio attivati dal Ca2+ _ad

elevata conduttanza [Jackson-Weaver O. et al. 2011] dimostrando così un particolare tropismo verso i canali del potassio come target farmacologico [Zhong GZ. 2010].

16 In accordo con tutti questi suoi effetti vascolari, la carenza di H2S endogeno può

essere coinvolta nella patogenesi dell'ipertensione.

Infatti, l'espressione/attività del CSE si riduce in ratti spontaneamente ipertesi. Inoltre, la somministrazione di H2S esogeno riduce la pressione sanguigna nei ratti

ipertesi mentre gli inibitori della CSE provocano un aumento dei livelli pressori nei ratti normotesi. Quindi, H2S è probabilmente un regolatore chiave del tono

vascolare in condizioni fisiologiche e la sua produzione può essere ridotta in alcuni tipi di ipertensione [Yan H. et al. 2004].

L’azione vasorilasciante promossa da H2S sulla muscolatura liscia vascolare, si

esplica sia in vasi di grosso calibro, che in vasi di resistenza periferica, questi ultimi in particolare svolgono un ruolo chiave nella regolazione della resistenza vascolare periferica e della pressione arteriosa [Zhao W. et al. 2001].

1.2.2 Ruolo protettivo a livello vascolare

1.2.2.1 Protezione di H

S da danno ossidativo (H

O

)

L’ossigeno è una molecola essenziale per la sopravvivenza degli organismi aerobi; tuttavia, a causa della sua struttura atomica che non gli permette di accettare doppietti elettronici, può generare intermedi altamente instabili noti come specie reattive dell’ossigeno (ROS) [Gutteridge JM. et al. 2000].

17 Queste specie sono il risultato di successive riduzioni monoelettroniche fino alla completa riduzione dell’ossigeno ad H2O e possono essere suddivise in due

categorie:

a) i radicali liberi dell’ossigeno (ad es. O2.- e OH.), che contengono un elettrone

spaiato;

b) le specie non radicaliche (ad es. H2O2).

L’anione superossido, che è il primo radicale libero che si forma come intermedio durante le reazioni biochimiche di riduzione dell’ossigeno, viene convertito nel perossido di idrogeno più stabile mediante la superossido dismutasi (SOD).

Il perossido di idrogeno è ulteriormente ridotto ad acqua e ossigeno da catalasi e perossidasi.

A fronte di una pericolosa, seppur fisiologica, produzione di specie reattive dell’ossigeno, la cellula ha sviluppato un complesso sistema antiossidante, che attraverso meccanismi enzimatici e non, è in grado di proteggere le molecole biologiche. I sistemi di difesa enzimatici includono proteine quali la superossido dismutasi (SOD), la glutatione perossidasi (GPx) e la catalasi (CAT); i sistemi di difesa non enzimatici sono rappresentati invece dall’acido ascorbico (Vitamina C), dall’α-tocoferolo (Vitamina E), dal glutatione (GSH), da carotenoidi, flavonoidi e altri antiossidanti.

18 Uno squilibrio nello stato redox in cui i fattori pro-ossidanti travolgono la capacità antiossidante di questi sistemi, porta allo stress ossidativo, che a sua volta provoca infiammazione vascolare [Lopes R.A. et al. 2015].

Indichiamo per cui con il termine di “stress ossidativo” una situazione dinamica nella quale coesiste uno squilibrio tra specie pro-ossidanti, in eccesso, e antiossidanti, in difetto (Sies H. 1991).

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) e le specie reattive dell’azoto (RNS) sono prodotti del normale metabolismo cellulare, il cui duplice ruolo, nei sistemi viventi, è oramai noto [Valko M. et al. 2006].

Bassi livelli di ROS determinano un aumento della progressione del ciclo cellulare, mentre livelli più elevati ne causano l’arresto e successivamente necrosi o apoptosi [Boonstra J. 2004].

Alte concentrazioni di ROS quindi risultano potenzialmente tossiche per la cellula poiché possono indurre danni molecolari irreversibili, quali l’ossidazione di polifenoli, catecolammine e tioli, l’inattivazione di enzimi, l’ossidazione di proteine, DNA e lipidi di membrana. Tali alterazioni sono spesso alla base di numerosi stati patologici come la senescenza, l’aterosclerosi, la neurodegenerazione, il diabete, l’ischemia ed il cancro [Droge W. 2002].

Lo stress ossidativo elevato quindi è un fattore riconosciuto nello sviluppo di molte malattie cardiovascolari [Khaper N. et al. 2010; Fukai T. et al. 2011] e, a tal riguardo, l’H2S è stato identificato come un agente antiossidante, sia a livello neuronale

19 [Kimura Y. et al. 2010; Whiteman M. 2004] che cardiovascolare [Yang Z. et al. 2011; Mishra P.K. et al. 2010; Yan S.K. et al 2006; Jeney V. et al. 2009; Muzaffar S. et al. 2008; Wang R. 2011].

Nella produzione delle specie reattive dell’ossigeno, l’azione della NADPH ossidasi, come precedentemente detto, produce il radicale anione superossido che, spontaneamente o enzimaticamente, dismuta per formare perossido idrogeno. [Powers S.K. et al. 2008].

L'H2S è stato ampiamente descritto come forte agente riducente, in grado di

neutralizzare molte specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto come: - il perossinitrito [Whiteman M. et al 2004; Dahm CC. et al. 2006]; - anione superossido [Geng B. et al. 2004A; Chang L. et al 2008]; - ipoclorito [Whiteman M. et al. 2005; Laggner H. et al. 2007]; - perossido di idrogeno [ Geng B. et al. 2004A];

- NO [Whiteman M. et al. 2006, Ali M. Y. et al. 2006],

nonostante ci siano prove chimiche che questi effetti anti-ossidanti di H2S siano

limitati dalla presenza di O2 a causa delle sua capacità di reagire in modo

competitivo con l'ossigeno molecolare stesso [Stasko A. et al 2009] .

È stato anche dimostrato che H2S, oltre a interagire con le specie reattive

dell'ossigeno, riduce l'accumulo di perossidazione lipidica [Geng B. et al. 2004], downregola l'espressione e l'attività della NADPH ossidasi [Muzaffar S. et al. 2008, Samhan-Arias A. K. et al. 2009], riducendo così la produzione di anioni superossido. Infine, H2S promuove la sintesi di GSH e l’assorbimento di cisteina, mentre riduce i

20 livelli di GSSG [Kimura H. 2002; Kimura Y. and Kimura H. 2004; Kimura Y. et al. 2006; Wei HL. et al. 2008] suggerendo quindi il ruolo di agente antiossidante e citoprotettivo.

Infatti, l’H2S esogeno riduce i livelli dell’anione superossido attraverso l'inibizione

della NADPH ossidasi nelle cellule di muscolatura liscia vascolare [Muzaffar S. et al. 2008].

La sovrapproduzione di anione superossido (O2.) derivato dalla NADPH ossidasi

(NOX) è coinvolta nell'eziologia di diverse patologie cardiovascolari, ecco perché si sostiene che l'inibizione di NOX, e di conseguenza la minore formazione di O2. può

rappresentare una strategia terapeutica nella prevenzione delle patologie cardiovascolari [Cai H. et al. 2003; Muzaffar S. et al. 2005].

È stato dimostrato che l’H2S ha un’ azione inibente sulla NOX a livello vascolare e

per definire quest’azione è stato testato l'effetto dell'idrosolfuro di sodio (NaHS), donatore di H2S, [Ali MY et al 2006] sia a lungo che a breve termine, sulla

formazione di O2. e sull’espressione di NOX-1 (una subunità attiva di NADPH

ossidasi) in cellule muscolari lisce umane isolate [Hordijk PL 2006; Janiszewski M et al 2005].

La neutralizzazione delle specie reattive dell’ossigeno da parte di H2S si traduce

nella protezione delle proteine e dei lipidi dal danno indotto. È stato dimostrato che H2S ha un ruolo citoprotettivo non specifico che si traduce nella soppressione della

produzione delle ROS, nella riduzione della 3-caspasi upregolata e nella prevenzione del calo di GSH [Chen S.L. et al. 2010].

21

1.2.2.2 Protezione di H

S da danno infiammatorio a livello

vascolare (High-Glucose)

Sebbene i meccanismi che collegano alti livelli di glucosio e vasculopatia diabetica non siano ancora ben definiti, l'iperglicemia è stata identificata come il fattore principale che contribuisce allo sviluppo di patologie vascolari associate al diabete mellito [The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, 1993 ; Stratton et al.2000 ]. Negli ultimi anni, tuttavia, un numero crescente di segnalazioni evidenzia un aumento dello stress ossidativo come fattore chiave nello sviluppo di anomalie vascolari nel diabete [Baynes J.W. 1991 ; Giugliano D. et al. 1996].

In questo modo, le alte concentrazioni di glucosio da solo o attraverso meccanismi di glicosilazione non enzimatica possono favorire una maggiore produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) [Giugliano D. et al.1996].

Oltre a presentare un’alterata funzione vasoattiva [De Vries A.S. et al. 2000], i vasi esposti ad alti livelli di glucosio possono subire cambiamenti nella loro struttura a causa di processi di rimodellamento. Tali processi sono principalmente determinati dall’ alterazione nei tassi di crescita (proliferazione o ipertrofia) e morte (necrosi o apoptosi) della muscolatura liscia vascolare, insieme all'espansione della matrice

22 extracellulare [Rasmussen L.M. et al. 1989; Rumble J.R. et al. 1997; Fukumoto H. et al. 1998 ].

Una volta stabilite, queste alterazioni strutturali che sono correlate a patologie vascolari come l'aterosclerosi o ipertrofia vascolare [Soulis T. et al. 1999], determinano morbilità e mortalità cardiovascolare nei pazienti diabetici.

Ad oggi la maggior parte degli studi volti ad analizzare l'effetto dell'alta glicemia sulla crescita delle cellule muscolari lisce vascolari e sui parametri di morte cellulare, è stata eseguita utilizzando cellule derivate da diversi modelli animali sperimentali. Ma successivi lavori, hanno mirato ad analizzare l'influenza di alti livelli di glucosio sulla crescita e la morte cellulare, utilizzando colture muscolari lisce vascolari derivate da vasi umani. [Concepción Peiró et al. 2001]

I ruoli dell'H2S nelle complicanze cardiovascolari correlate ad alti livelli di glucosio

hanno attirato notevole attenzione, a seguito di diversi risultati; in primo luogo, sono state osservate concentrazioni ridotte di H2S circolante in modelli animali con

diabete [Jain SK et al 2010; Suzuki K et al. 2011; Ahmad FU et al. 2012] e nei pazienti con diabete mellito di tipo 2 [Jain SK et al 2010; Whiteman M et al 2010].

Inoltre, bassi livelli di H2S nel sangue sono stati associati all'infiammazione vascolare

tipica della patologia diabetica mentre la somministrazione esogena del gas ha mostrato azione preventiva nei confronti della produzione di fattori infiammatori in monociti coltivati in terreno di coltura con alte concentrazioni di glucosio (HG) [Jain SK et al 2010].

Ulteriori studi hanno messo in evidenza che la somministrazione di H2S esogeno si

23 indotta da HG e delle lesioni causate da cicli di ischemia/riperfusione (IR) nel miocardio di topi e ratti diabetici [Peake B.F. et al. 2013; Gao Y. et al 2011].

Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che l'H2S esogeno protegge le cellule

cardiache H9c2 dal danno e dall'infiammazione indotte da HG [Xu W. et al. 2013; Zhuang X.D. et al 2014; Xu W. et al. 2015].

Anche se è stato visto che diversi fattori, tra cui agenti antiossidanti, anti-apoptotici e anti-infiammatori, l'inibizione di alcune vie di segnalazione intracellulare, come la protein-chinasi mitogeno-attivata (MAPK) [Xu W. et al 2013], leptina [Zhuang X.D. et al. 2014] e il fattore nucleare κB (NF-κB) [Xu W et al 2015], contribuiscono agli effetti protettivi di H2S contro il danno indotto da HG, i meccanismi responsabili di

questi effetti protettivi di H2S rimangono poco chiari.

Poiché studi precedenti hanno indicato che l'H2S attiva i canali KATP sia nel cuore

[Geng B et al 2004; Bian JS et al 2006] sia nei tessuti vascolari [Zhao W. et al. 2001] svolgendo un ruolo chiave nel meccanismo di cardioprotezione [Bian J.S. et al. 2006; Eisen A. et al. 2004; Akao M. et al 2001; Yamada S. et al. 2006; Zingman L.V. et al. 2004; Sierra A. et al. 2013], è stato quindi ipotizzato che questi canali possano essere coinvolti negli effetti protettivi che l'H2S esercita contro il danno indotto da

HG.

Altre ricerche hanno rivelato che il diabete mellito è associato alla disfunzione dei canali KATP cardiovascolari [Weintraub N.L. 2003]. L'iperglicemia infatti sembra

24 liscia vascolare umana [Miura H. et al. 2003; Kinoshita H. et al. 2004; Kinoshita H. et al. 2006].

In conclusione, diversi studi hanno dimostrato che il diabete è associato a livelli circolanti più bassi di solfuro d’ idrogeno, e che H2S può giocare un ruolo

fondamentale di protezione contro il fenomeno dell'infiammazione vascolare. Per cui, la somministrazione esogena di donatori di H2S o di L- cisteina, precursore

endogeno di H2S, possono inibire significativamente il danno vascolare causato

25

2. SCOPO DELLA RICERCA

Sulla base degli effetti fisiologici esplicati da H2S a livello vascolare come quelli

vasorilascianti, antinfiammatori e antiossidanti descritti nel capitolo introduttivo, risulta necessario individuare nuove molecole in grado di rilasciare questo gas. Lo scopo del seguente lavoro di ricerca è stato quello di valutare l’attività di un nuovo composto di sintesi (BW) in grado di rilasciare H2S a livello intracellulare e di

studiare i suoi effetti sull’iperpolarizzazione della della muscolatura liscia vascolare e di protezione nei confronti del danno ossidativo e infiammatorio. Inizialmente si è voluta determinare la capacità di BW di rilasciare H2S all’interno delle cellule

mediante esami in vitro su linea cellulare HASMC (cellule di muscolatura liscia di aorta umana).

In seguito è stata valutata la capacità di BW di indurre la variazione del potenziale di membrana cellulare delle HASMC in presenza e in assenza di bloccanti specifici dei canali del potassio, KV7, KATP e BKCa.

Infine è stata investigata la capacità di BW di intervenire in maniera positiva sul danno ossidativo provocato da perossido di idrogeno e sul danno infiammatorio indotto da alte concentrazioni di glucosio, preservando la vitalità cellulare.

26

3. MATERIALI E METODI

3.1 Materiali e metodi per la sperimentazione in vitro su

cellule HASMC.

3.1.1 Colture cellulari

Nelle procedure sperimentali sono state impiegate, come substrato biologico, cellule di muscolatura liscia di aorta umana (HASMC, human aortic smooth muscle cells) (Invitrogen©): queste cellule sono state opportunamente conservate a -196° C in un dewar contente azoto liquido. Durante lo stoccaggio in azoto liquido, al fine di proteggere le cellule in sospensione da eventuali danni fisici dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio è stata addizionata al mezzo di coltura una percentuale pari al 10% di dimetil solfossido (DMSO). Il mezzo di congelamento così composto permette di tenere le cellule in uno stato di quiescenza anche per anni, mantenendone intatte le caratteristiche.

27 Fig 3.1: Cellule HASMC al micriscopio ottico.

3.1.2 Mezzo di coltura

Il mezzo di coltura utilizzato per mimare l’ambiente fisiologico è un mezzo liquido e sterile preparato a partire dal Medium 231 (Life Technologies©), mezzo base contenente varie componenti utili per la crescita cellulare, come amminoacidi essenziali e non essenziali, sali inorganici, glucosio ecc. Al momento dell’apertura il mezzo base è stato addizionato di un’aliquota di 5 ml di una miscela antibiotica di penicillina/streptomicina, previa rimozione di un equivalente volume di mezzo di coltura, e di 25ml di un fattore di crescita denominato SMGS (smooth muscle growth supplement, Life Technologies©) costituito da componenti utili ad incentivare la proliferazione cellulare. Il fattore di crescita supplementare (SMGS) è un liquido sterile, fornito dalla ditta in bottiglie da 25 ml, quantità necessaria ad essere addizionata a 500 ml di mezzo di coltura. SMGS si compone di ormoni, estratti di tessuti, insulina e FBS (fetal bovine serum), ingredienti indispensabili per

28 favorire la crescita delle HASMC. La miscela antibiotica e il fattore di crescita supplementare sono opportunamente conservati in congelatore e scongelati al momento dell’utilizzo grazie all’ausilio di un bagno termostatato e aperti sotto cappa a flusso laminare, così da garantirne la sterilità. Il mezzo di coltura è preparato in ambiente sterile sotto cappa a flusso laminare ed è conservato in frigo (ad una temperatura di 4° C) per un tempo non superiore a 4 settimane, ad ogni utilizzo esso viene riscaldato a 37° mediante bagno termostatato.

3.1.3 Soluzioni tampone utilizzate durante i protocolli

sperimentali

Nel corso degli esperimenti è stata utilizzata una soluzione tampone, denominata “Buffer Standard”, al fine di garantire il mantenimento del pH cellulare e dell’equilibrio ionico. La soluzione tampone è stata preparata in laboratorio seguendo la composizione riportata in Tabella 1:

SOLUTO Concentrazione (Moli/L) Peso Molecolare g/L HEPES 20mM 238,3 4,776 NaCl 120Mm 58,44 7,013 KCl 2mM 76,56 0,419 CaCl2 x 2H2O 2mM 147,82 0,296 MgCl2 x 6H2O 1mM 203,31 0,203

29

Glucosio

5mM 198,17 0,991

Tabella 1: Composizione Buffer standard.

Le sostanze sono state pesate e solubilizzate in acqua bidistillata, posta sotto costante agitazione grazie ad una piastra magnetica e una barretta agitatrice. Dopo aver ottenuto la solubilizzazione di tutte le componenti è stata effettuata la regolazione del pH ad un valore pari a 7.4, grazie all’ausilio di un pHmetro.

La soluzione è stata conservata a 4°C ed utilizzata per ogni protocollo sperimentale dove previsto, previo riscaldamento alla temperatura di 37°C mediante bagno termostatato. Un’altra soluzione tampone usata nelle fasi preliminari degli esperimenti e in procedure come il cambio mezzo che sono necessarie per la rimozione delle cellule morte dalla superficie della piastra è la soluzione Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (Sigma Aldrich©), stoccata a temperatura compresa tra 2-8°C e contenente una miscela di sali di MgCl2 e CaCl2.

3.1.4 Gelatina

La gelatina è stata utilizzata in due dei protocolli sperimentali (per la valutazione dell’iperpolarizzazione di membrana e per il rilascio di H2S intracellulare, dov’è

prevista una semina di 72.000 cellule per pozzetto), per aumentare l’adesività delle cellule HASMC al fondo dei pozzetti delle piastre utilizzate. La gelatina è stata preparata in laboratorio solubilizzando 1 g di gelatina suina (Sigma Aldrich©) in

30 100ml di DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline) mediante l’uso di una piastra riscaldante con agitatore magnetico regolata ad una temperatura di circa 80°C (la soluzione non deve andare in ebollizione). La soluzione ottenuta dopo un’ora di agitazione continua è stata filtrata sotto cappa a flusso laminare utilizzando filtri con pori di 25µm, aliquotata e conservata in frigo ad una temperatura di 4°C. Al momento di ogni utilizzo la gelatina è stata riscaldata mediante bagno termostatato, favorendone il passaggio allo stato liquido e rendendo possibile la deposizione nei pozzetti. 100 µl di gelatina sono stati addizionati ad ogni pozzetto, incubati per 20 minuti a 37 °C e rimossi prima della piastratura al fine di lasciarne solo un leggero film sul fondo del pozzetto e rimuoverne l’eccesso.

3.1.5 Sostanze utilizzate durante i protocolli sperimentali e loro

soluzioni

Durante le procedure sperimentali sono state utilizzate le seguenti sostanze: 1) Sonde fluorimetriche:

1. DiBac(4)3 (Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) (Sigma Aldrich©) per la valutazione delle variazioni del potenziale di membrana cellulare.

La sonda è stata sciolta in DMSO alla concentrazione di 500 μM e conservata a -20°C; al momento dell’utilizzo la sonda è stata scongelata mediante bagno termostatato e diluita in Buffer Standard così da ottenere una concentrazione di 2,5μM nel pozzetto;

31 2. WSP-1 (3' - methoxy - 3 - oxo - 3H - spiro [isobenzofuran - 1,9' - xanthen]

- 6' - yl 2- (pyridin2 - yldisulfanyl) benzoate) (Cayman Chemical ©) per la

valutazione del rilascio intracellulare di H2S.

La sonda è stata sciolta in DMSO alla concentrazione di 2mM e conservata a -20°C; al momento dell’utilizzo la sonda è stata scongelata mediante bagno termostatato e diluita in Buffer Standard in modo da ottenere una concentrazione di 100μM nel pozzetto.

2) Sonda colorimetrica:

1. WST-1 (Roche©) o sale di tetrazolio (water soluble tetrazolium salt-1) (cell proliferation reagent): di colore rosa chiaro , viene trasformato dagli enzimi mitocondriali di cellule vitali in sale di formazano, solubile in acqua e di color arancio.

Si tratta di un saggio colorimetrico che fornisce un indice di vitalità cellulare in seguito a danno. La sonda è direttamente aggiunta nei pozzetti in rapporto finale di 1:10.

3) Sostanze:

32 2. tripsina-EDTA 1% soluzione (Sigma Aldrich©);

3. BW: composto H2S-donor in esame sintetizzato nei laboratori di chimica del

prof. Binghe Wang della Georgia States University.

La soluzione madre di BW 30mM in DMSO è stata diluita in Buffer Standard al fine di ottenere concentrazioni finali nel pozzetto di 300µM, 100µM e 30µM, (per le sperimentazioni inerenti all’azione iperpolarizzante e al rilascio di H2S intracellulare) , e diluita in mezzo di coltura al fine di ottenere

concentrazioni di 30µM, 10µM e 3µM (nei protocolli di valutazione della vitalità cellulare).

4. NS1619 (1,3-Diidro-(1-2-idrossi-5-(trifluorometil)fenil)-5-(trifluorometil)-2H-benzimidazol-2-one) (Sigma Aldrich©). Composto iperpolarizzante di riferimento in grado di attivare i canali del potassio BKCa.

La sostanza è stata disciolta in un opportuno volume di DMSO puro così da ottenere una soluzione madre di 20mM; si è poi operata una diluizione della madre con Buffer Standard al fine di ottenere una concentrazione pari a 10μM nel pozzetto.

5. DADS (Diallildisolfuro) (Sigma Aldrich©). Composto di riferimento H2

S-donor naturale utilizzato nella valutazione di rilascio di H2S intracellulare.

La sostanza è stata disciolta in un opportuno volume di DMSO puro così da ottenere una soluzione madre di 100mM; si è poi operata una diluizione della madre con Buffer Standard al fine di ottenere una concentrazione pari a 100μM nel pozzetto.

33 6. XE991 ( 10, 10– bis(4pyridinylmethyl) – 9 (10H) – anthracenone

-dyhydrochloride) (Tocris©) bloccante selettivo dei canali Kv7, utilizzato per verificare il coinvolgimento di questo canale nell’azione di BW a livello della muscolatura liscia vasale.

La soluzione madre in acqua bidistillata avente una concentrazione pari a 2mM è stata diluita in Buffer Stardard al fine di ottenere una concentrazione nel pozzetto pari a 10µM.

7. IbTx (iberiotossina) (Sigma Aldrich©) bloccante dei canali BK, utilizzata per verificare il coinvolgimento di questi canali nell’azione di BW a livello della muscolatura liscia vasale.

La soluzione madre in acqua bidistillata avente una concentrazione pari a 20µM è stata diluita in Buffer Standard al fine di ottenere una concentrazione nel pozzetto pari a 100nM.

8. Glibenclamide (Sigma Aldrich©) sulfanilurea bloccante dei canali al potassio KATP, utilizzata per verificare il coinvolgimento di questi canali

nell’azione di BW a livello della muscolatura liscia vasale;

La soluzione madre di 20mM in DMSO è diluita in Buffer Standard al fine di ottenere una concentrazione di 10µM nel pozzetto finale.

9. H2O2 (perossido d’idrogeno) (Alvita©) utilizzato per indurre danno

34 La soluzione iniziale al 3%p/v (880mM) è stata diluita in mezzo di coltura al fine di ottenere una concentrazione nel pozzetto di 200µM.

10. Glucosio (Sigma Aldrich©) utilizzato per indurre danno da high-glucose considerato responsabile di danno di tipo infiammatorio a livello vascolare.

La soluzione madre di glucosio al 45%p/v in acqua sterile (2,5M) è diluita in mezzo di coltura privo di siero al fine di ottenere una concentrazione finale nel pozzetto di 25mM.

3.1.6 Protocollo sperimentale

Tutte le operazioni sono state svolte sotto cappa a flusso laminare previamente resa sterile dai raggi UV. Sono stati utilizzati sia strumenti asettici sottoposti a processo di sterilizzazione che materiale plastico presterilizzato monouso. Al fine di garantire la riproducibilità degli esperimenti si è reso inoltre necessario attenersi a metodiche sperimentali validate e ripetibili.

3.1.6.1 Scongelamento

Lo scongelamento è un processo preliminare, che prevede il prelievo dei criotubi contenenti le cellule in quiescenza dal dewar, dove vengono preservate a -196° e il loro trasferimento in fiasca. Questo procedimento deve avvenire il più rapidamente possibile per evitare che le cellule a temperatura ambiente vengano danneggiate

35 dal DMSO presente nei criotubi. Una volta prelevato il criotubo dal dewar viene collocato in ghiaccio per essere trasportato al bagnomaria dove rapidamente si scongela la sospensione cellulare. Ottenuto lo scongelamento, si porta sotto cappa a flusso laminare, dove il contenuto del criotubo viene trasferito in una falcon e a questo vengono aggiunti gradualmente 5-6ml di mezzo di coltura, precedentemente scaldato a 37°C; successivamente si centrifuga la sospensione a 1100 rpm per 5 minuti, si aspira il surnatante grazie a una pompa da vuoto e si risospende il pellet ottenuto in circa 3ml di mezzo di coltura fresco. La sospensione ottenuta viene quindi trasferita in una fiasca da 75cm2 _{(T75) nella quale sono già}

stati aggiunti circa 7ml di mezzo di coltura, ed infine posta in incubatore a 37°C e 5% di CO2. Nei giorni successivi allo scongelamento, fino al raggiungimento della

confluenza sulla superficie diadesione della fiasca, il mezzo di coltura esausto viene sostituito con quello fresco ed eventuali residui o cellule morte in sospensione vengono asportati mediante lavaggi con DPBS.

3.1.6.2 Piastratura

Le cellule crescono all’interno della fiasca fino ad occupare l’intera superficie disponibile e quando raggiungono una confluenza pari a circa l’80% possono essere staccate, contate e poi seminate nella piastra. La piastratura permette di ottenere un numero stabilito di cellule all’interno di ogni pozzetto, che verrà poi trattato con differenti concentrazioni di sostanze secondo un planner prestabilito, così da poter confrontare i diversi trattamenti sul medesimo numero di cellule. Successivamente si procede al distacco delle cellule dalla fiasca, previo lavaggio con circa 5 ml di

36 DPBS, utilizzando 3 ml di una soluzione tripsina/EDTA (la tripsina è un enzima proteolitico che stacca le cellule dal fondo della fiasca e ne degrada la membrana, mentre l’EDTA ne aumenta l’attività chelando il magnesio e il calcio). La tripsina viene lasciata a contatto con le cellule in incubatore per circa 3 minuti, al termine dei quali si procede alla neutralizzazione dell’azione proteolitica della tripsina mediante l’aggiunta di circa 6ml di mezzo di coltura, evitando che questa vada a danneggiare le membrane cellulari o che si formino dei cluster (agglomerati cellulari) dovuti alla parziale fusione delle membrane. Infine si trasferisce la sospensione cellulare in una falcon da 15ml da cui vengono prelevati 20µl ed immessi nella camera di Burker (Fig 3.2) grazie alla quale si effettua la conta al microscopio ottico. Sapendo che ogni quadrante (con un’area di 1 mm2_{) dei nove}

che compongono il reticolo contiene un volume di 0,1 μL, è possibile risalire al numero totale di cellule a disposizione moltiplicando il numero medio di cellule contate, sia per il fattore 104 _{sia per il volume della sospensione da cui sono stati}

prelevati i 20 μl. Successivamente, per determinare il volume da prelevare dalla sospensione per ottenere il numero di cellule che deve essere effettivamente piastrato, è necessario impostare una proporzione tra il numero di cellule totali e quello che si desidera seminare; considerato che in ogni pozzetto devono essere immessi 100 μL di sospensione, il volume ottenuto deve essere poi diluito in uno specifico quantitativo di mezzo di coltura che dipende dal numero di pozzetti da piastrare. Al termine della procedura, la piastra viene riposta nell’incubatore per consentire l’adesione delle cellule ai pozzetti seminati per l’esperimento, mentre la sospensione cellulare in eccesso viene nuovamente trasferita in fiasca così da

37 permettere alle cellule di crescere e di raggiungere nuovamente la confluenza per svolgere esperimenti nei giorni successivi.

Fig 3.2: Camera di Burker.

Le procedure sperimentali dove vengono impiegate le sonde fluorescenti (DiBac(4)3 e WSP-1) necessitano dell’utilizzo di piastre multiwell 96 pozzetti nere con fondo trasparente, sulla cui superficie è presente uno strato di polilisina che, assieme alla gelatina, garantisce l’adesione delle cellule (Fig 3.3). La procedura per le cellule HASMC data la loro bassa adesività, prevede l’impiego di 100µl di gelatina all’1% in ogni pozzetto, al fine di creare, una volta rimossa la gelatina tramite aspirazione, un sottile film sul fondo. Per entrambi gli esperimenti sono state piastrate 72.000 cellule per ogni pozzetto. Per i protocolli invece che hanno visto l’impiego di sonda WST-1, sono state utilizzate piastre multiwell 96 pozzetti in plastica trasparente (Fig.3.4), nelle quali sono state seminate 10.000 cellule per ogni pozzetto senza alcuna aggiunta di gelatina.

Per ogni piastratura la stessa procedura è ripetuta per i “bianchi”, ovvero pozzetti privi di cellule necessari per sottrarre i valori di fluorescenza e di assorbanza aspecifici.

38 Fig 3.3: Piastra nera da 96 pozzetti utilizzata per gli esperimenti in fluorescenza.

Fig 3.4: Piastra trasparente da 96 pozzetti per esperimenti in assorbanza.

3.1.6.3 Esperimenti in fluorescenza

Al fine di assicurare una perfetta adesione delle cellule sul fondo dei pozzetti, l’esperimento vero e proprio è stato effettuato a 24h di distanza dalla piastratura.

39 Durante il lavoro di tesi sono stati svolti due differenti tipologie di esperimenti in fluorescenza: 1) Esperimento con la sonda fluorimetrica DiBac(4)3: per valutare la variazione del potenziale di membrana indotta dal composto in esame; 2) Esperimento con la sonda fluorimetrica WSP-1: per valutare la quantità di H2S

rilasciato all’interno delle cellule dal composto in esame. In ogni esperimento è stato utilizzato almeno un composto di riferimento (ad attività nota documentata dalla letteratura) allo scopo di valutare al meglio le variazioni dei composti in esame. Gli esperimenti sono stati condotti al buio con l’ausilio di specifiche luci IR per non interferire con l’attività delle sonde fluorescenti.

3.1.6.3.1 Esperimento con sonda DiBac(4)3

Per questo protocollo sperimentale vengono piastrate 72.000 cellule per ciascun pozzetto su piastra nera. La prima procedura effettuata è la preparazione della soluzione della sonda. Successivamente si procede alla rimozione del mezzo esausto dai pozzetti e all’aggiunta di 190µl della soluzione medicata con la sonda DiBac(4)3 alla concentrazione di 2,5µM (Fig 3.4), lasciandola in incubazione con le cellule per 1 ora affinché possa avvenire la distribuzione della sonda ai due lati della membrana cellulare.

40 Fig 3.5: Struttura chimica di DiBac(4)3.

Il DiBac(4)3 è una sonda della famiglia dei bis-oxonoli anionici, e la presenza della carica negativa le permette di distribuirsi ai due lati della membrana plasmatica seguendo il gradiente elettrochimico, ovvero il movimento degli anioni ai due lati della membrana cellulare. La sonda entra nella cellula a seguito di una depolarizzazione e si lega a specifici residui proteici emettendo una fluorescenza analizzata poi allo spettrofluorimetro; la sonda che rimane localizzata all’esterno della cellula invece non emette alcuna fluorescenza. Dopo 1 ora di incubazione vengono effettuate le prime tre letture spettrofluorimetriche mediante l’ausilio di un lettore multipiastra (Enspire, Perkin Elmer©), così da determinare i valori di fluorescenza basale; lo strumento è settato per effettuare letture ogni 2 minuti e 30 secondi (λ eccitazione 488nm - λ emissione 520nm). Una volta rilevata la fluorescenza basale, la piastra viene estratta dallo strumento e portata nuovamente sotto cappa dove avviene il trattamento con 10µl della sostanza in esame, a varie concentrazioni, seguendo il planner prestabilito, infine la piastra viene introdotta nuovamente nell’Enspire e si legge la variazione di fluorescenza

41 nel tempo per 35 minuti. Il planner utilizzato prevede l’impiego di trattamenti in triplicato: le cellule sono state quindi messe a contatto col solo veicolo all’1% di DMSO, con NS1619 10µM controllo positivo rappresentante il 100% dell’effetto iperpolarizzante e con le concentrazioni decrescenti della sostanza in esame ovvero BW 300µM, 100µM e 30µM.

La sonda DiBac(4)3 è stata impiegata anche in un protocollo che prevede l’uso dei bloccanti XE991, glibenclamide e iberiotossina. Per questo protocollo la sonda viene preparata estemporaneamente come di consueto, ma a seguito della rimozione del mezzo di coltura dalle cellule si aggiunge un volume di 180µl; dopo 1 ora di incubazione della sonda si effettuano tre letture basali e successivamente si aggiungono 10µl di ciascun bloccante in triplette diverse, mentre nelle altre vengono aggiunti 10µl di veicolo all’1% di DMSO per mantenere il volume finale omogeneo in tutti i pozzetti. A questo punto si effettuano 8 letture (una ogni 2,5 minuti) allo spettrofluorimetro per un totale di 20 minuti. Infine si aggiungono: la sostanza in esame, ovvero BW alla concentrazione selezionata di 30µM, o il veicolo all’1% o NS1619 10µM. Si procede con altre letture per 35 minuti. Tutti i trattamenti sono stati ripetuti nei pozzetti privi di cellule (“bianchi”).

42 Fig 3.6: Struttura chimica sonda WSP-1.

La sonda WSP-1 (Washington State Probe-1, Fig 3.6) viene utilizzata al fine di rilevare l’eventuale rilascio di solfuro di idrogeno all’interno delle cellule. Grazie alla presenza di un ponte disolfuro tra l’anello imidazolico e l’anello aromatico, essa è in grado di reagire rapidamente con il solfuro di idrogeno attraverso una reazione di sostituzione nucleofila, ottenendo così un prodotto caratterizzato sia dalla presenza di un gruppo tiolico libero sia da un gruppo estereo altamente elettrofilo: questo composto ciclizza spontaneamente a formare un benzoditiolone, rilasciando un fluoroforo.

43 Fig 3.7: Meccanismo grazie al quale la sonda WSP-1 è in grado di evidenziare la

presenza di H2S discriminandolo dai tioli organici.

Questa reazione è molto importante in quanto permette sia di catturare H2S come

prodotto stabile ed analizzabile (Fig 3.7 Composto B), sia di studiare la cinetica di rilascio del gas, in quanto la quantità di fluorescenza emessa dal fluoroforo è direttamente proporzionale alla quantità di solfuro di idrogeno presente nella molecola. La sonda è sensibile e selettiva verso il solfuro di idrogeno, in presenza di tioli organici, come la cisteina, reagisce a formare un composto che non è in grado di liberare il fluoroforo, tale composto infatti non presentando il gruppo tiolico libero non è in grado di ciclizzare (Fig 3.7 composto A2).

La sonda WSP-1 precedentemente disciolta in Buffer Standard fino ad ottenere una concentrazione di 100μM viene aggiunta, previa rimozione del mezzo esausto dalle cellule, in una quantità di 180µl in ogni pozzetto. La piastra è lasciata quindi in incubazione per 30 minuti prima di rimuovere la sonda non catturata dalle cellule, rimpiazzandola con un volume di Buffer Standard pari a 180µl; subito dopo la

44 multiwell è sottoposta ad una prima lettura spettrofluorimetrica per ottenere una misurazione della fluorescenza basale, per questo si compiono tre letture una ogni 5 minuti e la misurazione è effettuata ad λ eccitazione di 480 nm e λ emissione di 520nm. Si procede dunque con il trattamento delle cellule secondo un planner prestabilito che prevede il triplicato di ogni trattamento, ovvero alle cellule HASMC vengono aggiunti 20µl di veicolo all’1% di DMSO, di DADS 100µM (utilizzato come controllo positivo) e di BW a tre differenti concentrazioni: 300µM, 100µM e 30µM. Dopo le aggiunte si registra l’incremento di fluorescenza al lettore Enspire, per 35 minuti. Tutti i trattamenti sono stati ripetuti nei pozzetti privi di cellule (“bianchi”).

3.1.6.3.3 Esperimenti con WST-1

Il sale di tetrazolio o WST-1 viene convertito dalle cellule vitali in sale di formazano, virando da colore rosa chiaro ad arancio (fig. 3.8). Questa colorazione avviene grazie ad un meccanismo dipendente dalla formazione glicolitica di NADH e NADPH nelle cellule vitali, quindi la concentrazione di sale di formazano formata è direttamente correlata al numero di cellule metabolicamente attive nella coltura. Per questo motivo è utilizzato al fine di misurare la vitalità cellulare in seguito all’induzione di un danno.

45 Fig. 3.8: Conversione del WST-1 in sale di formazano.

La misura dell’assorbanza (Abs) è valutata mediante l’uso del lettore multipiastra, spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 450 nm (Enspire, Perkin Elmer©).

3.1.6.3.3.1 Esperimento per valutare l’effetto protettivo di BW

nei confronti del danno ossidativo

Il protocollo impiegato in questa fase prevede l’eliminazione iniziale del mezzo esausto dalle cellule HASMC e successiva aggiunta di 80µl di mezzo di coltura fresco. A questo punto è aggiunto, in due triplette, il solo veicolo all’1% di DMSO e nelle altre è previsto un pretrattamento con la sostanza H2S-donor in esame (BW)

46 Dopo 1 ora d’incubazione, in una delle due triplette che hanno ricevuto solo il veicolo e in tutte le triplette che hanno ricevuto il trattamento con le diverse concentrazioni di BW, si effettua un trattamento con H2O2 200 µM con la quale le

cellule staranno a contatto per 2 ore, inducendo così il danno ossidativo. Al termine delle 2 ore vengono aggiunti 10 µl di WST-1 a cui segue un ulteriore periodo d’incubazione di 1 ora prima di effettuare le letture tramite il lettore multipiastra Ensipre alla lunghezza d’onda di 450nm. Tutti i trattamenti sono stati ripetuti nei pozzetti privi di cellule (“bianchi”).

3.1.6.3.3.2 Esperimento per valutare l’effetto protettivo di BW

nei confronti del danno da High-Glucose

Trascorse 24 ore dalla piastratura, per questo protocollo sperimentale è previsto che il mezzo di coltura esausto venga aspirato e successivamente sostituito con 90µl di mezzo di coltura fresco al quale verrà aggiunto, secondo il planner prestabilito, il solo veicolo all’1% oppure le concentrazioni decrescenti di BW 30µM, 10µM e 3µM. La piastra viene incubata per 1 ora, al termine della quale viene nuovamente rimosso il mezzo di coltura da ogni pozzetto e sostituito con mezzo di coltura fresco con veicolo o con mezzo medicato “High-glucose” (cioè privato del siero e nel quale è stato disciolto glucosio al fine di ottenere una concentrazione finale di 25mM nel pozzetto) contenente BW alle stesse concentrazioni precedenti. A questo punto è prevista un’incubazione di 72ore.

47 Passate le 72 ore, si aggiungono 10 µl di WST-1 a cui segue un ulteriore periodo d’incubazione di 1 ora prima di effettuare le letture tramite il lettore multipiastra Ensipre alla lunghezza d’onda di 450nm. Tutti i trattamenti sono stati ripetuti nei pozzetti privi di cellule (“bianchi”).

3.1.7 Analisi dei dati delle colture cellulari

Negli esperimenti riguardanti la valutazione dell’iperpolarizzazione e il rilascio dell’H2S, la fluorescenza è stata misurata ad una lunghezza d’onda di eccitazione di

450 nm e di emissione di 520 nm mediante il lettore multipiastra EnSpire (Perkin Elmer©). Inoltre ad ogni dato registrato sia per le cellule trattate con BW che per quelle trattate con la sostanza di riferimento o esposte solo al veicolo è stato sottratto il valore dei corrispettivi ‘bianchi’, ovvero la fluorescenza registrata nei pozzetti contenenti i medesimi trattamenti ma privi di cellule. Nell’esperimento con la sonda DiBac(4)3, i valori acquisiti sono stati espressi come variazione di fluorescenza, calcolata con la seguente formula:

ΔF= (Ft – F0) /F0

Dove F0 è la fluorescenza di base prima dell’aggiunta dell’agente iperpolarizzante

mentre Ft è la fluorescenza al tempo t dopo l’aggiunta dell’agente iperpolarizzante. I grafici così ottenuti sono stati poi rielaborati al fine di calcolare l’area sotto la curva (AUC) e infine i dati di tutti i composti in esame sono stati espressi come AUC percentuale rispetto al valore di AUC del composto iperpolarizzante di riferimento

48 NS1619 alla concentrazione di 10μM. Nel caso degli esperimenti con la sonda WSP-1 le differenti quantità di H2S rilasciato dai composti sono state espresse come

indice di fluorescenza (FI) e le diverse AUC sono state messe a confronto con i valori del veicolo. L’elaborazione e l’analisi dei dati sono state effettuate mediante l’impiego del software Graph Pad Prism 6.0. L’analisi statistica è stata condotta mediante test statistico t di Student; un livello di p<0.05 è stato considerato come limite di significatività statistica (*p<0.05; **p<0.01; *** p<0.001).

Negli esperimenti con WST-1, l’assorbanza è stata misurata a 450nm mediante il lettore multipiastra EnSpire (Perkin Elmer©). La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale di assorbanza esibita dalle cellule sottoposte a insulto ossidativo tramite H2O2 o sottoposte a danno infiammatorio da High-Glucose rispetto alle

cellule in presenza di solo veicolo. I valori sono poi stati espressi come media ± errore standard. L’analisi statistica è stata condotta mediante test statistico t di Student; un livello di p<0.05 è stato considerato come limite di significatività statistica (*p<0.05; **p<0.01; *** p<0.001).

49 Il composto di nuova sintesi BW è stato dapprima studiato per le sue capacità di entrare all’interno delle cellule HASMC e di rilasciare H2S. In questo protocollo il

DADS, alla concentrazione di 100µM, è stato selezionato come composto di riferimento in quanto noto H2S-donor di origine naturale che in studi precedenti ha

mostrato la capacità di rilasciare H2S a livello intracellulare con una cinetica lenta e

graduale; tale cinetica è quella auspicabile per un H2S-donor che si voglia applicare

nella terapia di patologie cardio-vascolari come fonte esogena in grado di colmare l’eventuale mancanza di H2S endogeno.

In questo set di esperimenti il composto BW è stato testato a tre concentrazioni e la sua cinetica di rilascio dell’H2S è stata osservata per 50 minuti fino al

raggiungimento di un plateau.

La quantità di H2S rilasciata da BW e DADS all’interno delle cellule HASMC è stata

misurata attraverso un indice di fluorescenza (FI) ed espressa come area sotto la curva (AUC) dell’incremento di fluorescenza nell’arco dei 50 minuti di osservazione (Grafico 1).

Il composto BW ha esibito una capacità di rilasciare H2S concentrazione-dipendente

(AUC del FI di BW 30µM: 73703 ± 9732, di BW 100µM: 114550 ± 10187, di BW 300µM: 169482 ± 5554) che è risultata statisticamente significativa per tutte le concentrazioni testate, ma che ha raggiunto livelli paragonabili a quelli evocati da DADS 100µM (AUC del FI di DADS 100µM: 188059 ± 11997) solo alla concentrazione massima di BW 300µM (Grafico 2).

50 10 20 30 40 50 0 3000 6000 9000 Veicolo 1% DMSO DADS 100M BW 300M BW 100M BW 30M minuti In d ic e d i fl u o re s c e n z a d e l ri la s c io d i H2 S ( F I)

Grafico 1: Variazione della fluorescenza emessa nel tempo dalla sonda WSP-1 a seguito del rilascio di H2S intracellulare dopo trattamento delle cellule HASMC con veicolo (1% di DMSO), con DADS 100µM, con BW 30µM, con BW 100µM e con BW 300µM (curva blu scuro). Le barre verticali indicano l’errore standard.

Vei colo 1% DM SO M DA DS 100 M  BW 30 M  BW 10 0 M BW 30 0 0 50000 100000 150000 200000 250000

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Grafico 2: Area sotto la curva della variazione della fluorescenza emessa nel tempo (50min) dalla sonda WSP-1 su cellule HASMC trattate con veicolo (1% DMSO), con DADS 100µM, con BW 30µM, con BW 100µM e con BW 300µM. Le barre verticali indicano l’errore standard mentre gli asterischi (*) si riferiscono ad un valore di rilascio del solfuro di idrogeno significativamente differente da quello del corrispondente veicolo (**p<0,01; ***p<0,001).

Dopo aver dimostrato le capacità H2S-donor del composto di nuova sintesi BW, il

lavoro di tesi si è concentrato sulla valutazione delle proprietà iperpolarizzanti di membrana su cellule HASMC come parametro prodromico all’effetto vasorilasciante. Tale parametro, misurato attraverso la diversa fluorescenza emessa dalla sonda DiBac4(3) a seguito di variazioni del potenziale di membrana, è stato confrontato con l’azione evocata da un composto iperpolarizzante di riferimento, ovvero NS1619 10µM già utilizzato in studi precedenti [Martelli A. et al. 2014]. La capacità del composto BW di iperpolarizzare la membrana delle HASMC è stata monitorata per circa 40 minuti (Grafico 3) e successivamente espressa come percentuale dell’area sotto la curva rispetto al valore evocato da NS1619.

Il composto BW ha indotto un’azione iperpolarizzante chiaramente concentrazione-dipendente e statisticamente significativa alle tre concentrazioni testate (AUC % dell’effetto iperpolarizzante rispetto a NS1619 di BW 30µM: 48 ± 3, di BW 100µM: 90 ± 5, di BW 300µM: 163 ± 6) raggiungendo addirittura valori superiori a quelli evocati da NS1619 10µM alla concentrazione di 300µM (Grafico