4. Risultati e Discussione
4.2 Analisi dell’espressione genica
4.2.1 Studio della variabilità dovuta ai ritmi circadiani
Lo studio della variabilità dovuta ai ritmi circadiani è stata effettuata mediante due
metodi: il primo, analizzando la variabilità intra-individuale per ciascun soggetto e il
secondo, controllando l’assenza di variabilità tra i due gruppi di soggetti prelevati in
periodi diversi dell’anno. Nel primo metodo è stata effettuata la variabilità intra-
individuale confrontando tra loro i livelli di espressione ottenuti dai singo
ievi per
ciascun soggetto. Per questo scopo è stata utilizzata l’analisi PCA di cui riportiamo
un’esempio riferito ad uno dei soggetti studiati e prelevato per sei volte nell’arco di
tempo di 18 giorni. Come si evince dalla figura 4
sentativa di tutti i soggetti, la
maggior parte dei geni (circa il 92% in questo caso) tra quelli analizzati e inclusi nel
cipal non v ia nel empo in termini di espressione genica.
e significativa nei livelli di
pressione nel tempo. Gli altri componenti, presi nel complesso, identificano quei geni che subiscono
un’oscillazione per effetto dei ritmi circadiani (6%).
li prel
, rappre
componente prin
e
ar
t
92
%
2.5%
1.5%
Figura 4. Esempio di analisi PCA (Principle Component Analysis, GeneSpring) applicata ai campioni
ottenuti da un singolo donatore (età: 33; sesso: F). In ogni grafico è riportato l’andamento temporale di
ciascun gruppo di geni identificato dal programma (componenti) e la relativa percentuale dei geni. Circa
il 92% dei geni (Componente 1, linea rossa) non mostra una variazion
es
0.9%
0.8%
0.7%
0.5%
0.5%
0.5%
92
%
2.5%
1.5%
92
%
2.5%
1.5%
0.9%
0.8%
0.7%
0.5%
0.5%
0.5%
0.9%
0.8%
0.7%
0.5%
0.5%
0.5%
Considerando nel complesso tutti i donatori, emerge che circa il 94% dei geni non
a un’oscillazione reale.
cambia espressione nel tempo e che solo un 6% di geni mostr
Inoltre, dal confronto dei livelli di espressione dei due gruppi di soggetti (secondo
metodo), risulta che non si verificano differenze di espressione in periodi diversi
dell’anno (figura 5). Questi risultati offrono la dimostrazione che la maggior parte dei
geni nel tempo non viene influenzata dai ritmi circadiani o da altri fattori temporali
come ipotizzato inizialmente.
Figura 5. Esempio di espressione genica nel tempo in singoli donatori prelevati in stagioni diverse
dell’anno (GeneSpring software). Donatore SS (età, 38; sesso, M; prelevato in inverno), donatore GB
(età, 34; sesso, F; prelevata in estate-autunno).
i
E’ importante verificare una stabilità nel tempo in termini di espressione per poter
procedere nella valutazione di altre variabili come l’influenza dell’età, analizzata nella
seconda parte del nostro disegno sperimentale.
I geni ottenuti dall’analisi PCA che variano di espressione nel tempo sono stati
utilizzati per determinare quali classi funzionali di geni sono soggette alle oscillazioni
temporali. Il software Ingenuity (Unilever) è stato applicato per individuare il
raggruppamento dei geni in clusters di processi biologici basandosi sulle interazion
riportate in letteratura. I pathways funzionali, classificati in base alla loro importanza,
sono riportati in tabella 1.
Tabella 1. Analisi dei pathways (Ingenuity software). Dei 6600 geni analizzati, 486 geni (circa il 6%)
oscillano in maniera significativa nel tempo. La lista mostra la classificazione di questi geni in gruppi
funzionali (pathways) rappresentati in ordine di importanza in base al punteggio (score) assegnato
considerando il numero di geni significativi inclusi in ciascuno di essi (Focus Genes).
per-pathways.
el complesso, questi dati dimostrano che una minoranza di geni in cellule T di
sangue periferico ha un profilo di espressione che varia nel tempo e che questi geni
svolgono un ruolo in processi interconnessi tra loro. Inoltre, data l’importanza nel
considerare la fluttuazione dei livelli di trascrizione genica nel tempo quando vengono
analizzati dati provenienti da microarrays, è stato anche dimostrato che la stabilità di
espressione osservata determina una confidenza nell’applicazione di questa tecnica per
la valutazione di altre variabili come l’età.
I geni che oscillano nel tempo appartengono ad una vasta varietà di processi cellulari
la cui espressione può essere influenzata da molti fattori sia endogeni che esogeni.
Inoltre, molti di questi pathways interagiscono tra loro indicando che vi è una stretta
connessione tra i processi cellulari e che è possibile ridurre il numero delle classi
funzionali generando dei su
4.2.2 Analisi della variabilità inter-individuale
Dopo aver valutato che la maggior parte dei geni non cambia espressione per effetto
del tempo, è stata presa in considerazione l’identificazione di una possibile “signature”
genica che distinguesse i diversi donatori tra loro. Più in particolare è stata estratta una
lista di quei geni che sembrano avere un ruolo nella caratterizzazione individuale. In
figura 6 viene riportata l’analisi effettuata in riferimento all’approccio riportato in
Cheung et al, 2003.
za tra gli individui. Nel primo grafico di
inistra si osserva che la disposizione dei livelli di espressione tende a formare “due
ode”, una (in basso) che identifica la variabilità intra-individuale, e l’altra (in alto)
he identifica i geni che variano tra gli individui. Questi ultimi sono stati selezionati
n rosso) ad un livello di stringenza dello 0.01 e riportati in tabella 2 (pag. 62). Nel
Figura 6. Analisi della variabilità inter-individuale. In alto, i livelli di espressione genica vengono
visualizzati ponendo in ordinata la varianza tra le repliche (i prelievi ripetuti) e in ordinata la varianza
tra gli individui. In basso, i livelli di espressione vengono riportati in forma normalizzata. Nei grafici a
destra i dati sono stati randomizzati per eliminare l’effetto dovuto al caso. In rosso vengono selezionati i
geni che variano in modo significativo tra gli individui (p<0.05).
Nei grafici superiori è riportata, in ascissa, la varianza tra i prelievi effettuati da
ciascun soggetto e, in ordinata, la varian
s
c
c
(i
grafico di destra i dati sono stati mescolati casualmente per assicurare che l’effetto
una “signature” molecolare. Molti dei geni individuati svolgono
un ruolo nel metabolismo e nella sintesi proteica (ATP5D, CPT1B, RRBP1, etc), altri
SCYA4).
osservato fosse quello derivante dalla variabilità intra ed inter- individuale e non
quello dovuto al caso, fatto dimostrato dalla scomparsa delle “due code”.
In accordo con quanto riportato precedentemente, anche questo metodo ha dimostrato
l’assenza di variabilità tra i prelievi effettuati da ogni singolo donatore, mentre, è stato
possibile estrarre una lista di quei geni che sembrano caratterizzare ciascun individuo
quasi a rappresentare
sono coinvolti nella trasduzione del segnale (S100P/A8/A9, GPR56, etc) e solo alcuni
hanno una funzione nel sistema immunitario (TNFSF3, IL-10, LTF, BPI e
UniGene ID Descriptor Functional Category
Hs.89761 Homo sapiens ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, delta subunit (ATP5D), nuclear gene enco ATP biosynthesis [0006754] Hs.69321 Homo sapiens mRNA for KIAA1359 protein, partial cds cholesterol catabolism [0006707] Hs.13572 Homo sapiens calcium modulating ligand (CAMLG) mRNA defense response [0006952] Hs.1384 Homo sapiens O-6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) mRNA DNA repair [0006281] Hs.197345 Homo sa
Hs.29331 Homo sa Hs.24194 Homo sa
Hs.83381 Homo sa or protein signaling pathway [0007186]
Hs.6527 Homo sa or protein signaling pathway [0007186]
Hs.105938 Homo s Hs.193717 Human i Hs.89535 Homo s Hs.75703 Homo s Hs.137583 Homo s
piens thyroid autoantigen 70kD (Ku antigen) (G22P1) mRNA double-strand break repair [0006302] piens carnitine palmitoyltransferase I, muscle (CPT1B), mRNA fatty acid metabolism [0006631] piens folate receptor 2 (fetal) (FOLR2), mRNA folate transport [0015884] piens guanine nucleotide binding protein 11 (GNG11) mRNA G-protein coupled recept piens G protein-coupled receptor 56 (GPR56) mRNA G-protein coupled recept
apiens lactotransferrin (LTF) mRNA humoral defense mechanism [0006959] nterleukin 10 (IL10) mRNA, complete cds immune response [0006955]
apiens bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) mRNA immune response [0006955] apiens small inducible cytokine A4 (homologous to mouse Mip-1b) (SCYA4) mRNA immune response [0006955] apiens TNF superfamily, member 3 (LTB)-like (peptidoglycan recognition protein) (TNFSF3Limmune response [0006955]
apiens defensin, alpha 4, corticostatin (DEFA4) mRNA nitrogen metabolism [0006807] apiens cathelicidin antimicrobial peptide (CAMP) mRNA nitrogen metabolism [0006807] apiens ribosome binding protein 1 (dog 180kD homolog) (RRBP1), mRNA protein biosynthesis [0006412] apiens ribophorin I (RPN1) mRNA protein modification [0006464]
ens cathepsin G (CTSG) mRNA proteolysis and peptidolysis [0006508] apiens KIAA0423 mRNA, partial cds signal transduction [0007165] apiens S100 calcium-binding protein A8 (calgranulin A) (S100A8), mRNA signal transduction [0007165] apiens S100 calcium-binding protein A9 (calgranulin B) (S100A9), mRNA signal transduction [0007165] Hs.2582 Homo s Hs.51120 Homo s Hs.98614 Homo s Hs.2280 Homo s Hs.100764 Homo sapi Hs.111373 Homo s Hs.100000 Homo s Hs.112405 Homo s
Hs.2962 Homo sapiens S100 calcium-binding protein P (S100P), mRNA signal transduction [0007165]
Hs.80358 Homo sapiens SMC (mouse) homolog, Y chromosome (SMCY), mRNA transcription from Pol II promoter [0006366] Hs.26232 Homo sapiens mannosidase, alpha, class 2C, member 1 (MAN2C1), mRNA transcription from Pol II promoter [0006366] Hs.114360 Homo sapiens transforming growth factor beta-stimulated protein TSC-22 (TSC22) mRNA transcription regulation [0006355] Hs.283108 Human gamma-globin mRNA, 3' end transport [0006810]
Hs.305960 Homo sapiens hemoglobin, gamma A (HBG1), mRNA transport [0006810]
Hs.75545 Homo sapiens interleukin 4 receptor (IL4R) mRNA
Hs.76768 P4HA1 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4-hydroxylase), alpha polypeptide I Hs.51120 Homo sapiens cathelicidin antimicrobial peptide (CAMP) mRNA
Hs.19413 Homo sapiens S100 calcium-binding protein A12 (calgranulin C) (S100A12), mRNA Hs.112405 Homo sapiens S100 calcium-binding protein A9 (calgranulin B) (S100A9), mRNA Hs.1378 Homo sapiens annexin A3 (ANXA3), mRNA
Hs.374988 Homo sapiens FGF7 fibroblast growth factor 7 (keratinocyte growth factor) Hs.250 Homo sapiens xanthene dehydrogenase (XDH), mRNA
Hs.301961 GSTM1 glutathione S-transferase M1
Hs.272529 Homo sapiens glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D1 (GPLD1) mRNA Hs.283091 Homo sapiens found in inflammatory zone 3 (FIZZ3), mRNA
Hs.75627 CD14 antigenCD14 antigenHomo sapiens CD14 antigen (CD14) mRNA
Hs.297660 Homo sapiens TNF receptor-associated factor 3 (TRAF3) mRNA
Hs.114676 Homo sapiens tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11a, activator of NFKB (TNFRSF11A) mRNA
Hs.21814 Homo sapiens class II cytokine receptor ZCYTOR7 (ZCYTOR7), mRNA Hs.158324 Homo sapiens chemokine (C-C motif) receptor 3 (CCR3) mRNA Hs342 Homo sapiens protein kinase C, delta (PRKCD) mRNA Hs.26770 Homo sapiens fatty acid binding protein 7, brain (FABP7) mRNA
Hs.10315 Homo sapiens solute carrier family 7 (cationic amino acid transporter, y+ system), member 6 (SLC7A6) mRNA Hs.151738 Homo sapiens matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B, 92kD gelatinase, 92kD type IV collagenase) (MMP9) mRNA Hs.456713 MPO;Myeloperoxidase
Hs.193717 Human interleukin 10 (IL10) mRNA, complete cds
Hs.178237 Homo sapiens tyrosine hydroxylase (TH) mRNA Homo sapiens superoxide dismutase 1
Homo sapiens pyruvate dehydrogenase (lipoamide) beta (PDHB) mRNA Homo sapiens ATP synthase
Homo sapiens phosphofructokinase
Homo sapiens S100 calcium-binding protein A8 (calgranulin A) (S100A8) Homo sapiens secreted protein
Homo sapiens isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) gamma (IDH3G) mRNA Homo sapiens DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 2 (DNMT2) mRNA NDUFA10 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex
Homo sapiens NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 5 (15kD) (NADH-coenzyme Q reductase) (NDUF Homo sapiens folylpolyglutamate synthase (FPGS) mRNA
Homo sapiens putative allantoicase (LOC55821) Homo sapiens mutL (E. coli) homolog 1 (colon cancer
4.2.3Analisi immunofenotipica dei subsets linfocitari
Al fine di verificare che non vi fossero variazioni significative per effetto del tempo
nelle sottopopolazioni linfocitarie abbiamo analizzato l’immunofenotipo di ciascun
donatore ad ogni giorno di prelievo. Le sottopopolazioni linfocitarie osservate hanno
riguardato subsets importanti per l’immunosenescenza, in particolare: linfociti T
helper (CD4+), linfociti T citotossici (CD8+), linfociti T vergini e di memoria
(centrale e periferica) per entrambe le sottopopolazioni CD4+ e CD8+.
I risultati, espressi in percentuale per ogni singola sottopopolazione, sono stati
confrontati mediante il test statistico ANOVA ad una via. Due confronti sono stati
stesso dona
mpo, il
sottopopolazioni linfocitaria.
Infatti, mentre il primo approccio consente di identificare le differenze significative
per ciascuna popolazione linfocitaria nel tempo per lo stesso individuo, il secondo
metodo permette di valutare le differenze significative per ciascuna popolazione tra
individui diversi. I risultati di queste analisi mostrano che non c’è differenza tra le
atore osservate nel tempo (p>>0.01),
mentre risultati significativi sono stati rilevati confrontando i diversi donatori tra di
loro (p<0.01) come riportato in tabella 3.
Tabella 3.Analisi statistica effettuata mediante il test
ANOVA ad una via (1-way ANalysis Of VAriance).
Valori di P-value<0.01 vengono considerati significativi.
applicati: il primo tra le sottopopolazioni dello
tore osservate nel te
secondo, confrontando i diversi donatori per ciascuna
sottopopolazioni di linfociti T dello stesso don
0.9991 1.11E-16 Memoria periferica CD8 0.7287 1.29E-08 Memoria centrale CD8 0.6579 1.10E-11 Vergini CD8 0.8619 9.29E-11 Memoria periferica CD4 0.9323 5.08E-12 Memoria centrale CD4 0.9989 1.22E-15 Vergini CD4 P (nel tempo) P (tra individui) Sottopopolazioni linfociti T 0.9991 1.11E-16 Memoria periferica CD8 0.7287 1.29E-08 Memoria centrale CD8 0.6579 1.10E-11 Vergini CD8 0.8619 9.29E-11 Memoria periferica CD4 0.9323 5.08E-12 Memoria centrale CD4 0.9989 1.22E-15 Vergini CD4 Sottopopolazioni linfociti T P (tra individui) P (nel tempo)
Ciò suggerisce che ogni soggetto ha un proprio pattern di sottopopolazioni linfocitarie,
cuni geni data
Tabella 4. Lista dei ge
zia i fold changes ottenuti con le
due tecniche.
4.3.2 Analisi de
L’analisi dell’espressione genica in relazione all’età è stata condotta mediante
l’applicazione di
stata applicata una
seconda normali
lla classe E,
0.31 0.2 TNFAIP3 NM_006290 0.65 0.301 UCC1 AJ250475 0.19 0.325 MCpGBP2 X99687 0.45 0.365 SPINT1 AF086366 0.80 0.478 CASPASE 1 U13697 2.83 CALPONI NM_001299 1.59 SMAD NM_005359 1.55 2.048 TXNR2 NM_006440 3.45 2.174 3.12 2.207