Studio dell’espressione genica in relazione all’età

La validazione dei risultati di espressione è stata possibile solo per al

la ridotta quantità di RNA totale disponibile. Per lo stesso motivo è stato

indispensabile effettuare un pool di RNA per classe e non è stato possibile

indagare l’espressione nella classe di soggetti con età più avanzata. In tabella 4

vengono riportati i geni validati e i rispettivi fold changes ottenuti con i due

metodi. Come si può osservare, entrambe le tecniche hanno condotto a livelli di

espressione che mostrano lo stesso andamento e quantificazioni relative simili.

CGRRFD1 NM_006568 PCD5 AA902333 3.21 2.454 ADAM12 NM_003474 2.25 4.489 ARNT M69238

REAL TIME qRT-PCR FOLD- CHANGE ARRAY FOLD- CHANGE IN AGE COMMON NAME GENBANK ACCESSION 2.01 N 1 2.015 0.31 0.2 TNFAIP3 NM_006290 0.65 0.301 UCC1 AJ250475 0.19 0.325 MCpGBP2 X99687 0.45 0.365 SPINT1 AF086366 0.80 0.478 CASPASE 1 U13697 2.83 CALPONI NM_001299 1.59 SMAD NM_005359 1.55 2.048 TXNR2 NM_006440 3.45 2.174 3.12 2.207 2.01 N 1 2.015 CGRRFD1 NM_006568 PCD5 AA902333 3.21 2.454 ADAM12 NM_003474 2.25 4.489 ARNT M69238

REAL TIME qRT-PCR FOLD- CHANGE ARRAY FOLD- CHANGE IN AGE COMMON NAME GENBANK ACCESSION

ni validati con RT-PCR. La tabella eviden

ll’espressione genica

numerosi metodi statistici. Inizialmente, è

zzazione dei dati di espressione relativi a

successivamente è stata estratta una lista di 13000 geni utilizzata per l’applicazione

dei metodi statistici.

Normalizzazione dei dati e selezione dei geni

ne genica tra le diverse classi

i rispetto alle mediane

elli

ottenuti dal dataset dei gemelli MZ, paragonabile in quanto comprendente un range

ata estratta una lista di 481 geni (Dataset 2).

Ontology (GO) e raggruppare questi geni in grandi categorie funzionali. Da questa

aggior parte delle categorie coinvolte

degradazione delle proteine, (III) il metabolismo cellulare e (IV) la proliferazione e

Al fine di rendere confrontabili i profili di espressio

di età, i valori inerenti alla classe E sono stati normalizzat

delle classi A-B-C-D utilizzando la funzione LOESS. Questa ulteriore

normalizzazione è stata condotta poiché dall’analisi effettuata con PCA (Principal

Component Analysis) era emerso che solo la classe E (>90 anni di età) differiva dal

resto del dataset. In seguito alla normalizzazione il dataset è apparso più omogeneo

e per assicurare che questa seconda normalizzazione non abbia influenzato

l’andamento generale dei profili in relazione all’età, si è proceduto al confronto

degli “andamenti principali” (eigenmodes) post-normalizzazione con qu

di età fra i 22 e i 98 anni. Dal confronto è emerso che i patterns di espressione

genica in relazione all’età sono simili in entrambi i casi suggerendo che la

normalizzazione della classe E non influenza i risultati ottenuti in questo studio.

Al dataset è stato applicato il Modello Lineare basato sul confronto tra la classe di

soggetti di età più avanzata (E) e le altre classi di età: E-A, E-B, E-C, E-D.

L’applicazione della statistica F e di un test post-hoc (HB) per la correzione dei

dati, ha consentito di estrarre una lista di 1600 geni (Allegato A) che risultano

essere influenzati dall’età in modo significativo (p<0.05; Dataset 1). Un’ulteriore

analisi è stata condotta aumentando il livello di stringenza (p<0.01) per facilitare la

comprensione dei patterns di espressione in relazione all’età. Da questa analisi è

st

E’ possibile, indagare il ruolo di ognuno di loro, utilizzando il database Gene

analisi è stato osservato che la m

comprendono geni le cui attività si esplicano in meccanismi generali che sono alla

base della funzionalità cellulare come (I) la trasduzione del segnale dal recettore al

nucleo dove avviene la trascrizione, (II) i sistemi di trascrizione, trasduzione e

i meccanismi di morte cellulare. Ciò fa presupporre come con l’invecchiamento si

verifichino dei profondi cambiamenti a livello cellulare, una sorta di

modellamento generale che ha origine nella cellula ma che comporta

le e dell’organismo in toto.

biamenti che riguardano molecole

ri

inevitabilmente un cambiamento a livello tessuta

Tale rimodellamento acquista un significato crescente se consideriamo che la

popolazione oggetto di questo studio è proprio quella dei linfociti T che, come

largamente descritto in letteratura, subisce i cambiamenti più drastici con

l’avanzare dell’età. Facendo un’analisi più dettagliata, andando ad indagare

esclusivamente quelle categorie di geni che rivestono un ruolo importante nei

linfociti T, emerge che ad essere alterate sono le categorie coinvolte

nell’interazione citochina-recettore, nell’adesione e nella migrazione cellulare.

Infatti, dato il ruolo fondamentale di queste cellule nell’immunità cellulo-mediata,

queste tre funzioni rappresentano i meccanismi che sono alla base della corretta

funzionalità delle cellule T. In particolare, molti dei geni che subiscono un

oscillazione per effetto dell’età riguardano le molecole di espressione superficiali

dei linfociti T (15 geni coinvolti) tra cui CD8A/B, CD44, CD36, CD40L, CD59 e

CD69. Alcuni di questi geni aumentano in maniera lineare con l’età come il

marker CD59 che legando il componente C9 impedendo la formazione del MAC

del complemento. Altre molecole, invece, diminuiscono con l’avanzare dell’età,

come le catene α e β del marker CD8, dato già noto in letteratura, e il marker

CD44, coinvolto nell’adesione alle cellule endoteliali e alla matrice extracellulare

nonchè nell’aggregazione cellulare. Oltre alle modificazioni che avvengono

all’espressione di proteine superficiali della cellula T, ci sono altri cambiamenti

che riguardano la produzione di citochine/interleuchine e dei loro recettori. Sono

infatti più di 30 i geni coinvolti in questi cam

come le interleuchine (IL-1, 13, 24, 27, 32), alcune subunità di recettori delle IL

(IL-12RB, IL-17RB, IL-2RA/G, IL-21RB e IL-13RA1/2) e diversi

ligandi/recettori delle chemochine (CCR2, CCR5, CXCR7, CXCL14, CCL21 e

CCL25). Senza dubbio, una delle vie di segnalazione maggiormente alterate con

l’età è quella dell’IL-2, citochina che è nota essere il principale mediatore della

proliferazione dei lifociti T (stimolazione autocrina) e che svolge un ruolo nella

regolazione dell’immunità specifica. Tale molecola è prodotta principalmente dai

linfociti T con fenotipo CD4+ ed è in grado di legarsi al recettore IL-2R espresso

sugli stessi linfociti T dando origine alla trasduzione del segnale attraverso la via

Jak/STAT, utilizzata da diverse citochine, che determina nelle fasi finali la

trascrizione di geni importanti nella regolazione della proliferazione, nell’apoptosi

cellulare e nella produzione della stessa IL-2.

Dall’analisi dei geni coinvolti nella via di segnalazione di questa citochina, emerge

che vi è una diminuzione, con l’età, della responsività dei linfociti T a questa via di

segnalazione che determina una riduzione della proliferazione delle cellule T

dovuta a meccanismi autocrini. Infatti, alcuni geni codificanti per due subunità del

recettore dell’IL-2, RA e RG, hanno livelli di trascrizione che diminuiscono

abbondantemente con l’avanzare dell’età, così come accade per l’espressione del

gene ITK, una kinasi indotta dall’IL-2 che ha un ruolo nella trasduzione del

segnale e di alcuni geni codificanti per altre proteine di segnalazione appartenenti

alle famiglie Jak (Jak2 e 3) e STAT (STAT 1 e 4). In letteratura, diversi lavori

hanno dimostrato una diminuzione di questa via di segnalazione nei linfociti T

con l’avanzare dell’età (Bernstein and Murasko, 1998) ed altri, condotti su topi

“knock-out” hanno evidenziato che alterazioni alle subunità α e γ del IL-2R

determinano rispettivamente lo sviluppo di fenomeni autoimmuni e di un grave

stato di immunodeficienza (Willerford et al., 1995; Suzuki et al., 1995). Inoltre, la

diminuzione della produzione di IL-2 non ha effetto solo sui linfociti T in quanto

questa molecola svolge anche un ruolo di mediatore paracrino, andando ad

influenzare l’attività di altre cellule del SI come le cellule NK, mediando la

proliferazione e potenziando la loro attività citolitica; le cellule B, dove agisce sia

come fattore dei crescita che come stimolo per la produzione di anticorpi e sui

linfociti T attivati dall’antigene dove è capace di indurre la morte cellulare

promuovendo l’apoptosi.

Data l’importanza che riveste questa molecola nella funzionalità delle cellule T è

possibile ipotizzare che le modificazioni emerse dai nostri risultati, possano

spiegare la diminuzione della proliferazione dei linfociti T e la compromissione

delle funzioni mediate dalle cellule T che si verificano nell’invecchiamento.

Tra le altre modificazioni che emergono dall’analisi dei risultati vi è anche

un’alterazione del signalling del recettore dei linfociti T (TCR), dato dimostrato da

numerosi studi in letteratura. Il segnale del TCR collega il riconoscimento

dell’antigene alla risposta funzionale della cellula passando attraverso numerose

molecole proteiche che interagiscono tra loro. Più in dettaglio, il legame del TCR e

dei corecettori ai complessi MHC-peptide espressi sulle APC (cellule presentanti

l’antigene) innesca una serie di segnali precoci, che si trasducono

dell’invecchiamento. Inoltre, numerosi altri geni

rmini

progressivamente nella fosforilazione della catena ζ, nel legame ed attivazione di

ZAP-70, nella fosforilazione delle proteine adattatrici, e nell’attivazione di diversi

enzimi cellulari. Nel complesso, i segnali trasmessi dal legame antigene/recettore

attivano in maniera coordinata una serie di importanti vie biochimiche, quali la via

della chinasi Ras-MAP e di quella ad essa collegata Ras-SAP, la via della protein-

chinasi C (PKC) e la via della calcineurina. Gli enzimi attivati da ciascuna di

queste vie inducono la generazione di fattori di trascrizione (NFAT5, NF-kB, AP-

1) che stimolano l’espressione dei diversi geni coinvolti nella risposta dei linfociti

T. Dai nostri risultati emerge che numerose proteine che partecipano alla via di

segnalazione precoce del TCR e delle vie biochimiche attivate vengono alterate o

subiscono oscillazioni con l’età. Tra i geni principali vi è LIME-1 che codifica per

una proteina adattatrice transmembrana in grado di interagire con Lck, la cui

attivazione determina la fosforilazione della catena ζ e ZAP-70, proteina chiave

per il proseguimento nella segnalazione poichè codifica per una chinasi in grado di

fosforilare numerosi substrati. Il livello di trascrizione di questi geni tende a

diminuire drasticamente se paragoniamo i soggetti di età più avanzata con i

soggetti più giovani. Tale evidenza, almeno per il gene ZAP-70, è stata descritta in

molti studi che hanno preso in esame sia l’espressione che la sua attività di

fosfochinasi (Whisler et al., 1999; Fulop et al., 1999; Chakravarti et al., 2001)

mentre non risulta ancora chiaro se, e in che modo LIME-1 subisce una

modificazione per effetto

mostrano livelli di trascrizione che variano con l’età come quelli di geni codificanti

per enzimi appartenenti alla famiglia delle chinasi MAP (MAPK3K2, MAPK8IP1

e 2 e MAP6D1) e di alcuni tra i fattori di trascrizione peculiari delle cellule T quali

NFAT5 e NF-kB. Altri geni che subiscono variazioni per effetto dell’età in te

di espressione genica sono invece coinvolti nella vie attivate successivamente, in

particolare quella che segue all’attivazione della fosfolipasi C γ1 (PLC γ1). Questo

enzima, fosforilato da ZAP-70, viene attivato e idrolizza il PIP

2

(fosfatidilinositolo-difosfato) di membrana generando IP

3

(fosfatidilinositolo-

trifosfato) e DAG (diacilglicerolo), che mediano rispettivamente l’aumento dei

livelli citosolici di Ca

2+

e l’attivazione dell’enzima PKC (protein chinasi C).

L’avvio di questi due meccanismi determina a sua volta l’attivazione di diversi

fattori di trascrizione. Tra i geni che mostrano livelli trascrizionali alterati vi sono

quelli che codificano per alcune subunità della fosfolipasi C (PLCB1 e 2, PLCE1,

PLCH1, PLCL2) e per quelle della proteina chinasi C (PRKACG, PRKCH,

PRKCQ e PRKDC). Nel complesso, molti dei geni citati mostrano livelli di

trascrizione più bassi con l’avanzare dell’età; ciò potrebbe rendere ragione della

perdita di funzionalità che si verifica con l’età nelle cellule T. Inoltre, dato che la

trasduzione del segnale dal TCR determina numerosi effetti tra cui l’aumento dei

livelli citosolici di Ca

2+

e l’entrata del Ca

2+

dall’esterno, è possibile che,

modificazioni di altri geni coinvolti nella regolazione dell’omeostasi del Ca

2+

,

siano la causa della diminuita responsività dei linfociti T invecchiati. Infatti, sono

molti i geni che hanno un livello di espressione alterato per effetto dell’età, come

ad esempio geni che codificano per canali del calcio (CACNA1C, CACNA1I,

CACNG3), proteine che modulano il suo rilascio (CAMLG) o che semplicemente

legano o trasportano il calcio (CABP5, CALB1 e 2). Con l’invecchiamento si

potrebbe verificare una modificazione all’espressione di questi geni che, associata

alla diminuzione della segnalazione del TCR con conseguente riduzione dei livelli

citosolici di calcio, potrebbe determinare una diminuzione dell’attivazione di

numerosi enzimi calcio-dipendenti, dimostrazione che con l’età i linfociti T

subiscono una riduzione delle capacità funzionali. Dati simili sono stati evidenziati

da Sulger et al. che nel 1999 riscontrarono, in esperimenti effettuati su linfociti e

neuroni invecchiati, una diminuita risposta cellulare al calcio dovuta ad una

riduzione dell’espressione di proteine leganti Ca2+ come la calbindina (Sulger et

al., 1999).

Analisi dei pathways

Per verificare l’analisi effettuata precedentemente (mediante GO) sullo studio delle

caratteristiche dei geni che oscillano con l’avanzare dell’età, è stata eseguita

un’indagine più approfondita basata sull’individuazione di quelle classi funzionali

(pathways) maggiormente coinvolte nell’invecchiamento. I geni risultati

significativi sono stati inseriti nel database KEGG per la ricerca dei pathways ed

un’analisi di significatività è stata condotta sulla base del rapporto dei geni

significativi presenti in ciascun pathway utilizzando un test funzionale

ipergeometrico. Tale metodo ci consente, non solo di raggruppare i geni in base

alla loro funzione, ma di individuare quelle vie di segnalazione che ad oggi

risultano essere ben definite in letteratura consentendoci anche di individuare geni

con funzioni importanti che sembravano non particolarmente interessanti

attraverso la semplice ricerca effettuata con GO. Le principali classi funzionali

identificate dal Dataset 1 e dal Dataset 2 sono mostrate rispettivamente in tabella 5

e 6.

Pathways

P-value

Geni

Geni

Significativi

up/down

Long-term depression

0.012858

76

15

1

PPAR signaling pathway

0.015865

70

14

1

athione metabolism

0.016816

39

9

1

Glut

Glycan structures - biosynthesis 2

0.018709

62

1

-1

ECM-receptor interaction

0.020601

87

16

1

Small cell lung cancer

0.020601

87

16

1

SNARE interactions in vesicular transport

0.028283

36

0

-1

Glutamate metabolism

0.031604

30

7

1

T cell receptor signaling pathway

0.038957

93

16

1

Beta-Alanine metabolism

0.039984

25

6

1

l adhesion

0.040991

194

29

1

Foca

STAT signaling pathway

0.042025

153

24

1

Jak-

Taurine and hypotaurine metabolism

0.042664

8

3

1

ella 5. Lista dei pathways principalmente coinvolti nell’invecchiamento (Dataset 1). In verde

ono riportati i pathways alterati con l’età, mentre in rosso sono evidenziati quelli che non vengono

enzati in modo

Tab

veng

influ

significativo. Per ciascuna classe funzionale viene mostrato il numero di geni, quelli

che oscillano in modo significativo e un indice di coinvolgimento nell’invecchiamento (1, influenza

dell tà; -1, nessuna influenza). ’e

Pathways

P-value

Geni

Geni

Significativi up/down

Jak-STAT signaling pathway

0.001969845

153

13

1

ll cell lung cancer

0.009194476

87

8

1

Sma

Purine metabolism

0.009510008

144

0

-1

Cytokine-cytokine receptor interaction

0.019399122

258

16

1

dative phosphorylation

0.022133227

127

0

-1

Oxi

p53 signaling pathway

0.027718421

68

6

1

Complement and coagulation cascades

0.029532258

69

6

1

Inositol phosphate metabolism

0.031277047

52

5

1

Glycan structures - biosynthesis 1

0.033305949

115

0

-1

T cell receptor signaling pathway

0.038783921

93

7

1

Tab

veng

rtati i pathways alterati con l’età, mentre in rosso sono evidenziati quelli che non vengono

influ nzati in modo significativo. Per ciascuna classe funzionale viene mostrato il numero di geni, quelli

che oscillano in modo significativo e un indice di coinvolgimento nell’invecchiamento (up/down: 1,

influ nza dell’età; -1, nessuna influenza).

I pathways evi

verde indicano

h

o

i

ecchiamento (il numero

sig

i c

volti in ciascun

in tabella), mentre q

rtati in rosso rappresentano i

gnificativamen

i p

ffetto d ’età (il nu

ro

volti in ciascun path

er

rispetto a quello atteso).

i non s

e diverse sono

a

lli diffe

i. Per esem io,

appaiono regolati in

sig

icativa p effetto de età

prendono parte a

im

nitario e alle sue risposte

ratura com

era

ni cito

iù globale nell’invecchiamento.

Glutathione metabolism

0.042787167

39

4

1

ella 6. Lista dei pathways principalmente coinvolti nell’invecchiamento (Dataste 2). In verde

ono ripo

e

e

denziati in

quelli c e son influenzati

n modo

significativo nell’inv

dei geni

nificativ oin

pathway è riportato

uelli ripo

pathways che non vengono si

te alterat

er e

ell

me

dei geni significativi coin

way è inf iore

I pathways maggiormente significativ

ono conservati nei due dataset riflettendo

il fatto che funzioni biologich

coinvolte live

rent

p

come atteso, i geni che

maniera

nif

er

ll’

nelle cellule T (Dataset 2)

l sistema mu

che sono ben descritte in lette

e le int

zio

china-recettore, il

signalling del TCR e la via di segnalazione Jak-STAT.

Diversamente, oltre ai pathways specifici delle cellule T, il dataset 1 è più ampio e

include geni selezionati sotto un livello di stringenza minore e mostra pathways più

generici che non fanno riferimento esclusivamente al SI, ma descrivono una risposta

p

Il database KEGG, oltre a ricercare le classi funzionali maggiormente alterate,

fanno parte di ciascun pathway, m

a localizzazione (transme

pla

tica o nucleare) e

involgimento. Di seguito viene riportato un esempio di pathway

zione del TCR (figu

Come descritto in Nacu et al. (2007), la visualizzazione dei pathways coinvolti in un

fenomeno consente di ottenere maggiori informazioni rispetto alla semplice ricerca in

GO. Infatti, come è possibile osservare dall’immagine, appare che l’età non ha effetto

consente anche di visualizzare i geni che

ostrando le

interazioni tra loro, l

mbrana, cito

sma

il

loro grado di co

inerente la via di segnala

ra 7).

Figura 7. Pathway di segnalazione del recettore delle cellule T (TCR). In rosso sono evidenziati i

geni che oscillano in modo significativo per effetto dell’età, mentre in verde vengono riportati i geni che

non variano nell’invecchiamento.

solo sulla via di segnalazione del TCR, ma anche sulle vie che hanno origine dai

recettori per le molecole costimolatorie. La prima via interessa il marker CD28, una

proteina transmembrana che trasduce segnali complementari a quelli trasmessi dal

a costitutivamente su più del 90 %

ei linfociti T CD4+ e su circa il 50% delle cellule T CD8+, è in grado di legare la

ressione inizia a partire dai markers di superficie come le molecole CD8 (catene

D40 espresso sul linfociti B inducendoli a produrre

nticorpi. Una riduzione drammatica del livello di trascrizione avviene anche per il

complesso TCR per l’attivazione dei linfociti T vergini che iniziano così a proliferare

e a differenziarsi. Tale molecola, che viene espress

d

molecola costimolatoria B7-1 (CD80) espressa sulle APC trasducendo, all’interno del

linfocita T, dei segnali che inducono l’espressione di proteine ad azione anti-

apoptotica, stimolano la produzione di fattori di crescita e di citochine e favoriscono la

proliferazione e la differenziazione delle cellule T. L’altra via accessoria riguarda la

molecola transmembrana CTLA-4 (o CD152), strutturalmente omologo a CD28, ma

espressa esclusivamente su linfociti T CD4+ e CD8+ recentemente attivati. La sua

funzione è quella di inibire l’attivazione dei linfociti T (modulatore negativo)

contrastando i segnali trasmessi da CD28 e terminando la segnalazione.

Osservando la figura è evidente che le tre vie di segnalazione vengono alterate per

effetto dell’età a diversi livelli: il primo, a livello dei markers transmembrana e di

superficie da cui originano le segnalazioni (CD8A e B, CD40L, CTLA-4), il secondo,

a livello delle proteine citoplasmatiche dove avviene l’amplificazione dei segnali

(ZAP-70, SOS, PI3K, ITK, PAK, PKC8) e il terzo, a livello dei fattori di trascrizione

(NFAT e NF-kB) a cui segue l’espressione proteica. La visualizzazione delle

interazioni tra i geni e della loro localizzazione permette di verificare che molecole

intracellulari come ZAP-70 e PI3K svolgono un ruolo chiave rispettivamente nel

signalling del TCR e nella via costimolatoria mediata dal CD28. In generale, i nostri

dati sui livelli di trascrizione di questi geni, mostrano una diminuzione della

responsività dei linfociti T a queste vie di segnalazione. Infatti, la riduzione dei livelli

di esp

α e β) e CD40L (CD154), quest’ultimo operante come mediatore delle funzioni

effettrici delle cellule T helper, in quanto viene espressa nei linfociti T CD4+ attivati

ed è in grado di legarsi al marker C

a

gene CTLA-4 a partire dall’età di 70 anni; ciò potrebbe dar luogo, in soggetti di età

avanzata, ad una difficoltà nell’inibire l’attivazione dei linfociti T e il successivo

blocco della risposta causando un’induzione prolungata della produzione di citochine

pro-infiammatorie e della proliferazione cellulare. Dati in letteratura mostrano una up-

regolazione di questo gene con l’invecchiamento in seguito a stimolazione cellulare

(Wakikawa et al., 1997; Leng et al., 2002). Tale evidenza potrebbe rendere ragione

dell’esistenza di un meccanismo compensatorio in soggetti di età avanzata volto a

contrastare la difficoltà nel determinare lo spegnimento dell’attivazione cellulare.

Oltre alle molecole transmembrana, anche alcuni geni che codificano per proteine

citoplasmatiche mostrano livelli di espressione alterati con l’età; in particolare, la

maggior parte di loro evidenziano livelli più bassi in soggetti di età avanzata rispetto ai

soggetti giovani, pur non mostrando un andamento lineare considerando l’intera

lifespan. Tra questi geni troviamo ZAP-70, PKC, ITK e alcuni geni che codificano per

isoforme diverse di PI3K; essi diminuiscono complessivamente con l’avanzare

dell’età, mentre altri quali PAK e SOS1 hanno un andamento altalenante considerando

l’intera durata di vita. Infine, la riduzione dei livelli di trascrizione della Proteina

chinasi C (PKC) e dei livelli citosolici di Ca2+ (risultato della compromissione di ITK

e PLCγ) determinano rispettivamente la diminuzione dei livelli di NF-kB e di NFAT,

due regolatori fondamentali della trascrizione. NF-kB ha un ruolo chiave in molte

risposte immunologiche. Nella sua forma funzionale è un dimero composto da due

subunità, mentre nella cellula quiescente i dimeri sono presenti in forma inattiva nel

citoplasma, legati ad una o più proteine inibitrici chiamate inibitori di kB (IkB).

L’attivazione di NF-kB è innescata dalla degradazione di IkB, a sua volta avviata dalla

Nel documento Studi di espressione genica in linfociti T di soggetti di diversa età (pagine 64-93)