Analisi della localizzazione subcellulare di TFF

Considerando la capacità di TFF1 di interagire con il rame e l’influenza che quest’ultimo ha sulla formazione del dimero, nonché sul processo di secrezione della proteina, un conseguente interesse ha diretto l’indagine verso lo studio legato alla localizzazione cellulare di TFF1.

2.3.1 Esperimenti di co-localizzazione cellulare tramite microscopia confocale

L’esigenza di ottenere informazioni sul pathway di secrezione di TFF1 ha reso necessaria la messa a punto delle condizioni sperimentali adatte alla visualizzazione e localizzazione cellulare della proteina TFF1 e delle sue possibili variazioni legate ai livelli di rame mediante microscopia di immunofluorescenza. A tal fine sono stati preventivamente selezionati gli anticorpi commerciali più efficienti per la rivelazione intracellulare della proteina, per i quali non erano disponibili puntuali informazioni bibliografiche

Sono stati quindi esaminati diversi anticorpi anti-TFF1 e selezionato l’unico anticorpo efficace diretto contro l’intera sequenza nativa comprendente il peptide segnale (figura 2.16).

Figura 2.16 Immunofluorescenze. In rosso il segnale per TFF1 in cellule MCF-7.

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Si è proseguito nell’analisi della localizzazione cellulare scegliendo due modelli su cui condurre gli esperimenti: il clone inducibile AGS-AC1 e la linea di carcinoma mammario MCF-7, nota per esprimere in modo costitutivo elevate quantità di proteina (Prest et al., 2002). Queste cellule, così come descritto nel paragrafo 4.8.1 di Materiali e Metodi, sono state trattate per determinare condizioni di sovraccarico e deprivazione di rame. La localizzazione di TFF1 all’interno della cellula è stata analizzata mediante microscopia confocale, utilizzando come marker dei compartimenti cellulari la proteina Calnexina, per il Reticolo Endoplasmatico, e la proteina p58K per il trans-Golgi. Le cellule, trattate per 48 ore con il rame o con il suo chelante, sono state opportunamente preparate per l’osservazione al microscopio.

Le immagini raccolte per le due linee cellulari AGS-AC1 ed MCF-7 (2.17 e 2.18) mostrano che la proteina TFF1 co-localizza sia con il marker del Reticolo Endoplasmatico che con quello del trans-Golgi. Tale risultato evidenzia un percorso della proteina che coinvolge i compartimenti principalmente interessati nei dinamici processi di secrezione delle proteine. Nelle cellule trattate con rame, si osserva una maggiore localizzazione della proteina trifoglio nel trans-Golgi, come indicato dall’intensa colorazione gialla che deriva dalla sovrapposizione delle due immagini di fluorescenza del campo in esame.

Figura 2.17 Immunofluorescenze. Cellule MCF-7 sono state piastrate su vetrini e trattate con CuCl2

100 μM e BCS 500 μM. In rosso: TFF1; in verde: Calnexina (a dx) o p58K (a sx); in blu: nuclei cellulari. Le immagini di merge mostrano la sovrapposizione tra i segnali rossi e verdi indicano la localizzazione di TFF1 nel Reticolo Endoplasmatico e nel trans-Golgi. Il trattamento con il rame determina una maggiore co-localizzazione di TFF1 con il marker del trans-Golgi.

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2.3.2 Esperimenti di frazionamento cellulare

I risultati ottenuti dalle immunofluorescenze sono da considerarsi informazioni indicative, infatti si sono resi necessari ulteriori approfondimenti al fine di chiarire non solo l’eventuale compartimento preferenziale in cui il fattore trifoglio può localizzare al variare dei livelli di rame ma anche caratterizzare la forma con la quale la proteina si ritrova in tali compartimenti. La verifica delle evidenze ottenute dall’analisi di immagine microscopica è stata eseguita mediante frazionamento cellulare ed immunoblotting.

Il frazionamento cellulare consente la separazione degli organelli cellulari mediante centrifugazione su gradiente di densità con separazione zonale di velocità o isodensità all’equilibrio. In letteratura sono descritti efficienti protocolli di frazionamento, e per gli scopi perseguiti è stata elaborata una procedura di frazionamento in gradiente di densità discontinuo utilizzando il Nycodenz®, un derivato dell’acido benzoico appartenente alla classe dei non-elettroliti iodati. Rispetto al più comune saccarosio, le soluzioni di Nycodenz® conferiscono ai mezzi di frazionamento, una densità adatta a coprire la maggior parte del range di densità degli organelli, pur mantenendo una bassa viscosità e osmolarità.

Il frazionamento è stato eseguito su omogenati cellulari di adenocarcinoma gastrico inducibile AGS-AC1, che ha consentito una più facile individuazione della proteina ottenibile in quantità tecnicamente rivelabili per Western blotting nelle diverse frazioni del gradiente. Le cellule, sono state indotte con doxiciclina e contemporaneamente trattate con rame 100 μM per 48 h, al fine di valutare

Figura 2.18 Immunofluorescenze. Cellule AGS-AC1 sono state piastrate su vetrini e trattate con CuCl2

100 μM e BCS 500 μM. In rosso: TFF1; in verde: Calnexina (a dx) o p58K (a sx); in blu: nuclei cellulari. Le immagini di merge mostrano la sovrapposizione tra i segnali rossi e verdi indicano la localizzazione di TFF1 nel Reticolo Endoplasmatico e nel trans-Golgi. Il trattamento con il rame determina una maggiore co-localizzazione di TFF1 con il marker del trans-Golgi.

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l’influenza dei livelli di metallo sulla localizzazione sub-cellulare di TFF1. Come descritto nel paragrafo 4.8.2 di Materiali e Metodi, il Post Nuclear Surnatant (PNS) ottenuto è stato caricato su un gradiente pre-formato di Nycodenz® e ultra- centrifugato, ottenendo la separazione dei diversi organelli cellulari così come riportato dallo schema in figura 2.19.

Le frazioni ottenute sono state analizzate per Western botting. Per caratterizzare le frazioni sono stati utilizzati diversi anticorpi commerciali diretti contro proteine marker dei compartimenti cellulari, ma la scarsa e disomogenea efficienza di molti di loro ha costituito un impedimento per una più puntuale identificazione dei compartimenti. Dall’analisi Western appare evidente che TFF1 si accumula sia nelle frazioni al 10% che in quelle al 24%, che corrispondono rispettivamente al trans-Golgi e al Reticolo Endoplasmatico (Figura 2.20-a). Inoltre, dall’analisi densitometrica dei segnali ottenuti si osserva un maggior accumulo della proteina al livello del trans- Golgi in condizioni di sovraccarico di rame (Figura 2.21 b-c).

Figura 2.19 Schematizzazione del frazionamento cellulare su gradiente discontinuo di Nycodenz®.

Figura 2.21-a Frazionamento cellulare. Analisi Western blotting delle frazioni ottenute mediante frazionamento cellulare su gradiente discontinuo di Nycodenz® effettuato su cellule di controllo e cellule trattate con CuCl2 100 μM per 48h.

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Come accennato in precedenza, dati presenti in letteratura dimostrano che il trans-Golgi rappresenta uno dei principali siti di acquisizione del metallo da parte delle cupro-proteine. Vista la capacità di TFF1 di legare il rame tramite la sua estremità carbossi-terminale, è ragionevole pensare che l’ipotetico ruolo funzionale dei cuprocomplessi di TFF1 possa avere inizio con la sua sintesi o il suo accumulo nel trans-Golgi in condizioni di sovraccarico di rame.

2.4 Esperimenti di internalizzazione delle proteine ricombinanti