Caratterizzazione termodinamica dell’interazione tra il rame e il peptide trifoglio TFF

La stima dell’affinità di legame tra il rame e il peptide trifoglio si rende necessaria per ipotizzare - o interpretare - un eventuale significato biologico di questa

Figura 2.4 Caratterizzazione del complesso hrTFF3 monomerico-Cu2+ mediante analisi ESI-MS. Deconvoluzione degli spettri di hrTFF3 monomerico in assenza (a) e in presenza (c) di un eccesso molare x 7,5 di CuCl2. Il pannello (c) mostra la presenza del picco a 6750,5 Da corrispondente ad un

incremento di massa di circa 64 Da che indica la formazione del complesso Cu-monomero in rapporto 1:1. La presenza del picco (b) a 6726,5 Da è da attribuirsi alla formazione di un complesso con lo ione calcio. Il picco (d) indica invece che non vi è interazione della proteina hrTFF3 con lo ione zinco.

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interazione. La spettrometria di massa è in grado di fornire indicazioni di tipo qualitativo sui legami macromolecolari ma non consente di ottenere informazioni sui parametri termodinamici che caratterizzano la formazione di un complesso.

Gli studi già effettuati per confermare il coinvolgimento della regione C-terminale di TFF1 nell’interazione con il rame avevano utilizzato misure di fluorescence

quencing su un peptide sintetico in forma monomerica di sequenza corrispondente

agli ultimi 16 aa della proteina e contenente la sostituzione Phe60Trp sull’ultimo residuo. Da tali studi è emerso il coinvolgimento di tale regione nel legame con il rame e si è ottenuta una indicazione circa l’affinità di legame per il metallo che è risultata essere dell’ordine nanomolare (Tosco et al., 2010).

Per confermare tale risultato e verificare l’affinità di legame per il rame della forma dimerica della proteina, le misure sono state nuovamente effettuate mediante calorimetria isotermica di titolazione, al fine di ottenere più puntuali informazioni sulla costante di dissociazione (Kd), la stechiometria (n) e l’entalpia di interazione (ΔH) del complesso rame-TFF1. Analogamente a quanto già eseguito con gli esperimenti di fluorescenza, è stato utilizzato il peptide sintetico pTFF di sequenza nativa in forma dimerica, regione responsabile dell’interazione con il catione metallico. La formazione del dimero di pTFF è stata promossa incubando il peptide per una notte a temperatura ambiente. Le due forme sono state separate mediante HPLC e la conferma della massa molecolare è stata ottenuta mediante spettrometria di massa MALDI.

La fase di ottimizzazione dei parametri sperimentali in esperimenti di calorimetria di titolazione prevede l’individuazione di una concentrazione di molecole interagenti appropriata capace di produrre uno scambio di calore significativo ed apprezzabile nel range di sensibilità dello strumento. A tal fine, il calcolo del parametro adimensionale “c” (Wiseman et al., 1989), pari a:

c = nKa[M]T

(dove Ka è la costante di legame, [M]T è la concentrazione totale della macromolecola nella cella e n è la stechiometria di interazione) consente di stabilire un range di concentrazioni utili alle misure. Valori ottimali di c per una corretta stima dell’affinità di legame devono essere compresi tra 1 e 1000. Considerando costanti gli altri parametri, il valore di c può essere modulato variando la concentrazione della macromolecola.

Per costanti di legame molto elevate non si riesce ad ottenere misure utili ed attendibili per il calcolo, se non con accorgimenti capaci di attenuare l’affinità tra analita e titolante capaci di far rientrare le misure nell’intervallo di sensibilità dello strumento. A tal fine si utilizzano chelanti deboli che competano per il legame con il titolante.

Nel caso in esame, considerando l’indicazione ottenuta dagli esperimenti di

fluorescence quencing (Kd = 1,3 nM per il peptide monomerico) e facendo riferimento

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legame di complessi rame-proteina, è stata utilizzata la glicina (figura 2.5) come chelante debole per il rame.

Ulteriore vantaggio che deriva dall’utilizzo di un chelante debole è che esso, utilizzato in eccesso rispetto al ligando, previene la precipitazione del catione metallico sotto forma di idrossidi.

Le soluzioni di analita e di ligando sono state preparate così come descritto nel paragrafo 4.2 di Materiali e Metodi.

Prima di individuare le condizioni sperimentali che hanno consentito di ottenere gli esperimenti mostrati nelle figure 2.6 e 2.7, sono state condotte numerose prove variando la concentrazione di titolante, la concentrazione di titolato o la temperatura di analisi. In figura 2.6 è mostrata la titolazione del complesso rame-glicina nella cella contenente il solo tampone Hepes che consente di determinare il calore di diluizione dovuto alla dissociazione del complesso.

Figura 2.6 Calorimetria isotermica di titolazione. Dati grezzi della dissociazione/associazione del complesso Cu2+-Gly2 corrispondenti a 19 iniezioni di 0,7 mM rame / 2,8 mM glicina in tampone

Hepes 20 mM, NaCl 160 mM a pH 7,4 a 25 °C.

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In figura 2.7, invece, è mostrata la titolazione del complesso rame-glicina nella cella contenente il peptide dimerico pTFF1.

I dati sono stati analizzati utilizzando il software associato allo strumento (Origin 7.0), ottenendo così la costante apparente di associazione (Kapp), il numero di molecole di peptide legate al rame (n) e la variazione di entalpia (ΔH). I valori ottenuti però non tengono conto degli equilibri che si instaurano in presenza della glicina e del tampone. La costante apparente di associazione deve quindi essere corretta considerando questi equilibri. Facendo riferimento al lavoro di Trapaidze et al., 2012 è stata utilizzata l’equazione riportata nel paragrafo 4.2 di Materiali e Metodi, che ci ha consentito di ottenere il valore della costante di dissociazione reale, definita “condizionale” (Tabella 1).

Tabella 1. Variazione di entalpia e costanti di dissociazione del legame del rame al peptide sintetico dimerico pTFF1

ΔH (cal mol-1

) appKd (M)

cond

Kd (M) Siti di legame (n)

-4145 1,43 x 10-5 4,38 x 10-9 1

Figura 2.7 Calorimetria isotermica di titolazione. Nella parte alta del pannello sono mostrati i dati grezzi; in basso i dati integrati corrispondenti a 19 iniezioni di 0,7 mM rame / 2,8 mM glicina in una soluzione 70 μM peptide dimerico pTFF1. Gli esperimenti sono stati eseguiti in tampone Hepes 20 mM, NaCl 160 mM a pH 7,4 a 25 °C.

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Il valore della costante di dissociazione ottenuta è in accordo con i dati di

fluorescence quencing del peptide in forma monomerica e ci consente di affermare

che anche il peptide dimerico di TFF1, rappresentativo dell’estremità carbossiterminale della proteina, mostra una significativa affinità per il rame.

Analoghe misurazioni di ITC ancora non concluse, consentiranno di caratterizzare l’interazione tra il rame e le proteine ricombinanti hrTFF1 e hrTFF3.

2.2 L’influenza del rame sulla secrezione e la localizzazione cellulare di