ANALISI DELLA VITALITA’ CELLULARE

Il saggio di vitalità cellulare ci permette di stimare la vitalità di cellule trattate con determinate sostanze. In questo caso il saggio di vitalità è stato effettuato per valutare la potenziale attività farmacologica di due molecole (MC-23 e MC-24) su due linee cellulari, valutando la vitalità delle cellule: meno sono le cellule vive, maggiore sarà l’attività della molecola. Questa analisi è stata effettuata mediante il saggio con Rosso Neutro. Il Rosso Neutro (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) è un colorante in grado di superare la membrana cellulare delle cellule vive e dislocarsi a livello dei loro lisosomi. Il colorante non è però in grado di penetrare attraverso cellule morte che pertanto non appariranno colorate. Dopo il tempo necessario per l’incubazione delle cellule con le molecole MC-23 e MC-24, queste sono state trattate con rosso neutro che è stato aggiunto ad ogni pozzetto (1 μL di rosso neutro per 10 μL di mezzo). Le piastre sono state lasciate due ore nell’incubatore per permettere al colorante di penetrare attraverso le cellule vive. Una volta passate le due ore, le piastre sono state osservate al microscopio ottico, per controllare che non si fossero formati precipitati. Successivamente il mezzo è stato aspirato ed i pozzetti sono stati lavati un paio di volte con PBS per eliminare il colorante rimasto in soluzione. A questo punto viene aggiunta una soluzione di solubilizzazione costituita da acido acetico (1%), etanolo (50%) e acqua bidistillata (49%), in modo da permettere la fuoriuscita del colorante dai lisosomi delle cellule che erano rimaste in vita. La piastra viene messa in agitazione per 10 minuti sulla bascula e successivamente viene sottoposta a lettura tramite uno spettrofotometro a 540 nm. Tanto maggiore sarà la vitalità cellulare tanto più la colorazione risulterà intensa e pertanto maggiore sarà il valore dell’assorbanza rilevato dal macchinario. Ciascun valore di assorbanza viene sottratto del valore del bianco, per eliminare l’eventuale assorbanza emessa dal mezzo e normalizzato rispetto al controllo con DMSO. Per escludere ogni possibile interferenza del DMSO con il trattamento è bene verificare che i valori di assorbanza del non trattato e del pozzetto trattato con DMSO non siano troppo diversi.

Da questa analisi si ottiene l’IC50 della sostanza testata, ovvero la concentrazione

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