Analisi dell'espressione dei miR-142-3p e miR-223-3p in pazienti sottopost

L'espressione dei miR 142-3p e miR 223-3p è stata valutata nella popolazione di pazienti sottoposti a trapianto di rene ed in una popolazione di controllo (PC). La popolazione dei pazienti trapiantati è stata suddivisa, sulla base della filtrazione glomerulare in due sottogruppi (SFR e OD), come già descritto in materiali e metodi. Successivamente è stata analizzata l'espressione del miR-142-3p nelle popolazioni di pazienti trapiantati in riferimento alla terapia immunosoppressiva e al sesso.

I dati acquisiti durante la reazione di Real-Time PCR sono stati elaborati dal software BIO-RAD iQ5 che, tramite un algoritmo apposito, ha svolto automaticamente i calcoli del metodo ΔΔCt ed ha restituito l’espressione relativa e normalizzata dei geni target nei campioni analizzati rispetto ai nostri reference

genes (B2M e ACTB).

I risultati di espressione genica sono stati analizzati mediante il test t-Student e il test Kruskal-Wallis per valutare la significatività dei dati ottenuti. Il primo è un test statistico di tipo parametrico con lo scopo di verificare se la differenza tra le medie calcolate non è dovuta al caso, ma esiste realmente una diversità tra le

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medie delle due popolazioni da cui i campioni stessi derivano. Questo test può essere utilizzato per campioni appaiati oppure per campioni indipendenti; il primo consente di confrontare le medie di due variabili per un singolo gruppo e il secondo consente di confrontare le medie relative a due gruppi di casi. Nel nostro studio è opportuno utilizzare il test per campioni indipendenti.

Il Kruskal-Wallis è un test statistico di tipo non parametrico per campioni indipendenti, che non implica la stima dei parametri statistici. Inoltre, a differenza del test t-student non richiede che i dati abbiamo una distribuzione normale. L’intervallo di confidenza da noi utilizzato, in entrambi i test, per valutare la significatività dei dati ottenuti è del 95%. Valori di p<0,05 sono stati considerati significativi.

4.7.1 miR-142-3p

Confrontando i dati ottenuti nei pazienti SRF vs OD si può evidenziare una differenza statisticamente significativa (p(t-student)=5,8*10-16; p(Kruskal-Wallis)=2*10-4)

tra le medie dell’espressione del miR-142-3p. In particolare, tutti i pazienti SRF hanno valori di espressione più alti rispetto ai pazienti OD, che invece sono caratterizzati da sua bassa e costante espressione (Figura 42).

Figura 42. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del Fold Change del miR-142-3p nei soggetti sottoposti a trapianto di rene (OD e SRF) utilizzando come reference genes la B2M e la ACTB.

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Se confrontiamo i pazienti SRF con la popolazione di controllo (PC) riconfermiamo l’elevata espressione del miR-142-3p nella popolazione SRF e osserviamo invece una sua bassa espressione nella popolazione PC (Figura 43). Inoltre possiamo osservare che le due popolazioni OD e PC presentano un livello di espressione del miR-142-3p equivalente.

Figura 43. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del fold change del miR-142-3p nei soggetti sottoposti a trapianto di rene (OD e SRF) e nella popolazione di controllo (PC).

In riferimento alla tipologia di terapia immunosoppressiva a cui i pazienti trapiantati sono stati sottoposti, è stata effettuata un’analisi intra- ed inter- popolazione dell’espressione del miR-142-3p. L’analisi dei dati non ha messo in evidenza nessuna correlazione, statisticamente significativa, fra i livelli di espressione del miR-142-3p e il tipo di terapia (Figura 44-46).

t-student: SRF vs OD p=5,8*10-16 SRF vs PC p= 4,6*10-14 OD vs PC p=0,872 Kruskal-Wallis: SRF vs OD p=2*10-4 SRF vs PC p=4*10-4 OD vs PC p=0,495

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Figura 44. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del fold change del miR-142-3p nei pazienti sottoposti a trapianto di rene (SRF+OD) in relazione alla terapia immunosoppressiva.

Figura 45. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del fold change del miR-142-3p nei pazienti trapiantati SRF in relazione alla terapia immunosoppressiva.

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Figura 46. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del fold change del miR-142-3p nei pazienti trapiantati OD in relazione alla terapia immunosoppressiva.

Infine, è stata effettuata un’analisi intra- ed inter-popolazione dell’espressione del miR-142-3p suddividendo i pazienti trapiantati per sesso. I dati ottenuti non hanno mostrato valori statisticamente significativi (Figura 47-49).

Figura 47. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del fold change del miR-142-3p nei pazienti sottoposti a trapianto di rene (SRF+OD) in relazione al sesso.

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Figura 48. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del fold change del miR-142-3p nei pazienti trapiantati SRF in relazione al sesso.

Figura 49. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del fold change del miR-142-3p nei pazienti trapiantati OD in relazione al sesso.

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4.7.2 miR-223-3p

Per quanto riguarda il miR-223-3p i dati mostrano un livello di espressione costante in tutte e tre le popolazioni analizzate (SFR, OD e PC) (Figura 50). In particolare, come mostrato nella figura 51, i livelli di espressione del miR-223-3p risultano essere costanti nei singoli campioni analizzati con un livello di variabilità di espressione compresa fra 0,25-0,8 “Normalized Fold Expression”.

Figura 50. Valutazione mediante tecnica qRT-PCR del Fold Change dei miR-223-3p nei soggetti sottoposti a trapianto di rene (OD e SRF) e nella popolazione di controllo (PC). t-student: SRF vs OD p=0,795 SRF vs PC p=0,508 OD vs PC p=0,832 Kruskal-Wallis: SRF vs OD p=0,98 SRF vs PC p=0,248 OD vs PC p=0,099

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Figura 51. In questa figura sono riportati i dati del miR-223-3p per singolo paziente. I dati dimostrano una bassa variabilità del valore di Fold-Expression in tutti i soggetti analizzati.

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5. DISCUSSIONE

La scoperta dei miRNA ha rivoluzionato e chiarito molti aspetti della biologia cellulare aprendo nuove frontiere di indagini in numerose branche della medicina. Recenti studi indicano il coinvolgimento di alcune di queste molecole nei processi fisiopatologici del trapianto. I dati a disposizione però non sono sufficienti per definire con chiarezza un loro eventuale uso nella pratica clinica.

Nonostante le fasi di biogenesi dei miRNA siano processi intracellulari, tali molecole possono anche essere rilasciate nell’ambiente extracellulare dove prendono il nome di miRNA circolanti. Recenti dati indicano che essi possono essere successivamente trasportati ed internalizzati da cellule target, anche a notevole distanza dal punto di biogenesi. Infatti, una delle caratteristiche peculiari di queste molecole è la loro notevole stabilità e resistenza alla degradazione.

Lo scopo di questa tesi è stato principalmente quello di mettere a punto ed ottimizzare una metodica per lo studio dei miRNA mediate tecnica di qRT-PCR. Per la valutazione dell'espressione genica ci siamo basati sulla quantificazione relativa ottenuta mediante il metodo ΔΔCt. I livelli di espressione dei geni target sono stati normalizzati rispetto a geni di controllo, reference genes, al fine di correggere differenze di quantità e/o qualità del cDNA. Il metodo è stato reso estremamente robusto mediante opportuni accorgimenti tecnici, come ad esempio l'inserimento della Sequenza Nucleotidica "Spaziatrice", che ha consentito di ridurre al minimo i rischi di ampliconi aspecifici e ha facilitato il rilevamento dell’amplicone in fase di lettura.

Lo studio dei miRNA suscita grande interesse in ambito trapiantologico in quanto non sono stati ancora individuati dei marker affidabili per la diagnosi delle forme di rigetto. Infatti sarebbe molto interessante capire se esistono specifici miRNA o particolari pattern di espressione che possono essere utilizzati a questo scopo. In letteratura sono riportati molti geni coinvolti nell’apoptosi cellulare che potrebbero essere usati come indicatori nelle forme di rigetto del “graft”. L’applicazione è comunque limitata dal fatto che la maggior parte di questi studi è estremamente laboriosa ed in molti casi richiede una biopsia.

Le tecniche come la qRT-PCR consentono di monitorare i pazienti trapiantati in maniera estremamente semplice e non invasiva, utilizzando un prelievo di sangue

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periferico o di altri fluidi biologici. In pratica, se fosse chiaramente dimostrato che determinati miRNA possono essere utilizzati per il monitoraggio, l’induzione o il mantenimento di uno stato di tolleranza del “graft”, la tecnica della Real-Time PCR potrebbe rappresentare il "gold standard" per il monitoraggio post-trapianto sostituendo nel contempo quelle indagini di laboratorio rischiose come la biopsia. Nella seconda parte di questo studio ci siamo focalizzati nell'analisi di espressione di due specifici miRNA, il miR-142-3p ed il miR-223-3p. I dati della letteratura indicano un aumento della loro espressione in pazienti sottoposti a trapianto di rene in corso di rigetto d’organo. Difatti, uno dei limiti principali alla riuscita del trapianto è la risposta immunitaria del ricevente verso le cellule e i tessuti del donatore. Se il ricevente di un allotrapianto dispone di un sistema immunitario perfettamente integro, senza opportuni accorgimenti esita inesorabilmente in qualche forma di rigetto. Nonostante oggi siano disponibili farmaci di nuova generazione molto selettivi ed a bassa tossicità, che permettono di prolungare la sopravvivenza a breve termine dell’organo trapiantato, i rischi inerenti a tumori ed infezioni per un paziente trapiantato sono ancora elevati, in quanto le difese generali dell’organismo risultano almeno parzialmente compromesse.

E’ evidente quindi la necessità, da un lato di definire le strategie che inducano nel ricevente una tolleranza specifica per l’organo del donatore, dall’altro, di individuare e caratterizzare biomarker precoci capaci di permettere un monitoraggio molto accurato del trapianto. Queste necessità cliniche sono dettate dal fatto di eliminare, o perlomeno di ridurre drasticamente, i farmaci antirigetto e di intervenire precocemente in caso di perdita dello stato di equilibrio immunologico. Tali aspetti clinici sono probabilmente necessari per prolungare in modo indefinito la sopravvivenza del trapianto e soprattutto di migliorare la qualità di vita del paziente.

Per la messa a punto del metodo è stata utilizzata la tecnica della qRT-PCR attraverso la chimica del SYBR-Green. Tale procedimento è risultato essere semplice, pratico e poco costoso, a differenza delle altre metodiche.

Il programma Primer 3 si è dimostrato versatile e molto utile nella progettazione dei primer geni specifici e dei reference genes. L'utilizzo del software ha permesso di valutare ed ottimizzare l'inserimento della Sequenza Nucleotidica

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“Spaziatrice” permettendo di scegliere la lunghezza e la sequenza nucleotidica

più adatta. Il software GeNorm è stato molto utile per la selezione dei reference

genes. Sulla base del valore M dei 5 geni a disposizione (GAPDH, B2M, ACTB,

UBC e RNU-44), l'algoritmo ha permesso di scegliere come reference genes altamente stabili i geni B2M e ACTB.

L'ottimizzazione del protocollo ha richiesto l’impiego di molte prove in cui è stato modificato il profilo termico, in particolare la temperatura di annealing, e in alcuni casi anche la concentrazione dei primer. Dal grafico e dai parametri delle curve di amplificazione è stato possibile escludere la presenza di aspecifici e di alterazioni di segnale conseguenti a livelli elevati di rumore di fondo.

L’efficienza di amplificazione ed il coefficiente di determinazione (R2

) sono stati calcolati dallo slope delle curve di diluizione seriali eseguite per ogni gene; invece la specificità di amplificazione è stata confermata mediante la curva di melting, in cui abbiamo osservato la presenza di un solo picco. Il metodo che abbiamo messo a punto si è dimostrato essere altamente riproducibile, specifico e sensibile. Il metodo è stato utilizzato per valutare il livello di espressione dei due miRNA su una popolazione di pazienti sottoposti a trapianto di rene da cadavere. I dati hanno messo in evidenza un significativo aumento dell'espressione del miR-142-3p (p(t-student)=5,8*10-16; p(Kruskal-Wallis)=2*10-4) nella popolazione degli SRF rispetto

alla popolazione degli OD. Confrontando i pazienti SRF con la popolazione di controllo (PC) abbiamo riconfermato l’elevata espressione del miR-142-3p nella popolazione SRF. Nessuna differenza dei livelli di espressione del miR-142-3p è stata osservata confrontando la popolazione OD vs PC. Successivamente, l’elevata espressione del miR-142-3p è stata analizzata anche in relazione alla terapia immunosoppressiva e al sesso. I dati non hanno evidenziato nessuna correlazione statisticamente significativa, per cui probabilmente sia la tipologia del trattamento farmacologico post-trapianto che il sesso non sono dei cofattori che influenzano l’espressione del miR-142-3p.

Alcuni dati presenti in letteratura dimostrano che livelli aumentati di miR-142-3p e miR-223-3p sono associati a rigetto d'organo. Al contrario, i nostri dati hanno dimostrato che livelli aumentati di miR-142-3p correlano con una funzionalità stabile dell'organo. La nostra popolazione di pazienti trapiantati è costituita da

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pazienti SRF e OD, in particolare quelli con OD sono pazienti che presentano una VFG<35 ml/min. Nella nostra popolazione al momento dello studio non sono presenti pazienti con diagnosi di rigetto, pertanto non sono sovrapponibili a quelli riportati in letteratura. Verosimilmente i pazienti con OD presentano una condizione funzionale del “graft” instabile che andrebbe monitorata nel tempo allo scopo di valutare quali e quanti di questi pazienti esitano in una qualche forma di rigetto. Probabilmente, i livelli aumentati miR-142-3p riscontrati nella popolazione SRF sono implicati o contribuiscono al mantenimento di quello stato di equilibrio immunologico importante per preservare la funzionalità dell’organo. A questo aumento potrebbe contribuire anche l'efficacia della terapia immunosoppressiva che in maniera diretta o indiretta regolerebbe la biogenesi di specifici miRNA.

I livelli di espressione del miR-223-3p sono risultati essere costanti in tutti i soggetti analizzati e sembrerebbero non essere influenzati dallo stato funzionale del “graft” né tantomeno dalla terapia immunosoppressiva.

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6. CONCLUSIONI

La tecnica di qRT-PCR si è dimostrata versatile, altamente specifica e sensibile nello studio dei miRNA in pazienti sottoposti a trapianto di organo solido. Sebbene ancora preliminari, i nostri dati hanno messo in evidenza l'esistenza di una correlazione fra i livelli di espressione del miR-142-3p e lo stato di salute del

“graft”. In particolare, i livelli elevati di tale molecola riscontrati nella

popolazione SRF hanno permesso di ipotizzare che essi siano probabilmente necessari per il mantenimento di uno stato di equilibrio immunologico e di conseguenza dell’integrità funzionale del “graft”. Comunque, in una visione alternativa, si potrebbe anche ipotizzare che i livelli elevati del miR-142-3p rappresentino un epifenomeno conseguente all’efficacia della terapia immunosoppressiva.

Qualora questi dati fossero confermati su una popolazione con una maggiore numerosità, sarebbe estremamente interessante per una futura applicazione in ambito clinico, comprendere i meccanismi regolatori che stanno alla base dell’aumento dell’espressione del miR-142-3p.

Prima di stabilire se il miR-142-3p possa essere utilizzato come biomarker nel monitoraggio dei pazienti sottoposti a trapianto di rene da cadavere, sarebbe necessario effettuare un’analisi di espressione temporale pre e post trapianto a tempi predefiniti. Infine, sarebbe estremamente interessante valutare i livelli di espressione di questo marker nei pazienti Long Term Survival, ovvero in quei pazienti trapiantati da più di 10 anni che presentano una buona funzionalità renale e probabilmente con un conseguente equilibrio immunologico stabile.

Nel concludere questa breve discussione, ricordiamo che i nostri dati hanno evidenziato che il miRNA-223-3p non è probabilmente un marker informativo nel trapianto di rene.

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