1 ANALISI DI ESPRESSIONE TRAMITE RT-PCR

1.1 Animali

Gli esemplari di spigola (Dicentrarchus labrax L.) utilizzati per la sperimentazione sono stati allevati ad una temperatura di 15± 1° C presso l’impianto d’acquacoltura “Nuova Azzurro” (Civitavecchia, Roma). Gli animali sono stati alimentati con Artemia salina nauplii per 3-4 settimane a partire dallo stadio di 8 giorni dopo la schiusa (ph), e in seguito con Proton pellets (INVE, Belgium). Quindi,sono state campionati: uova, larve (2, 4, 6, 8, 13, 16, 21, 25 e 32 giorni dopo la schiusa), post-larve (39, 51, 62, 75, e 92 giorni dopo la schiusa), e timo di spigole di un anno (ancora sessualmente immature). I pesci sono stati anestetizzati con tricaina metano solfato (0.03%) in acqua, prima del campionamento. Per i campionamenti comprendenti le uova e gli stadi fino a 92 giorni ph sono stati fatti 3 pools costituiti ognuno da circa 50 animali, mentre per gli esemplari giovanili sono stati utilizzati timo e intestino provenienti da tre animali. Ai campioni è stato aggiunto 1 ml di Tripure (sigma) e si è triturato il tutto in eppendorf con un pestello sterile, fino ad ottenere una soluzione omogenea (idealmente contenente singole cellule).

1.2 Estrazione dell'RNA totale

Alle cellule in Tripure, sono stati aggiunti 0.2 ml di cloroformio per ogni ml di Tripure iniziale e la soluzione è stata agitata vigorosamente per 15 secondi. Il campione è stato incubato per 10 minuti a temperatura ambiente e poi centrifugato a 12000 rpm per 15 minuti a 4°C. La fase acquosa incolore, presente nella parte superiore del tubo da centrifuga, è stata trasferita in un altro tubo per precipitare l'RNA. Per fare ciò sono stati aggiunti 0.5 ml di isopropanolo per ogni ml di Tripure iniziale; la soluzione ottenuta è stata quindi agitata invertendo il tubo varie volte per miscelare bene il tutto, incubata per 10 minuti a temperatura ambiente e centrifugata a 12000 rpm per 10 minuti a 4°C. Il supernatante è stato eliminato ed è stato aggiunto 1ml di etanolo 75% (v/v) per ogni ml di Tripure iniziale. Il tutto è stato agitato vigorosamente per lavare il pellet e poi centrifugato a 12000 rpm per 10 minuti a 4°C eliminando il supernatante. L'eccesso di etanolo presente

sul pellet di RNA è stato rimosso facendolo evaporare ed il prodotto finale è stato poi risospeso in acqua con dietil-pirocarbonato (DEPC) 0.1% pipettando più volte il campione e successivamente quantificato misurando l’assorbanza a 260 nm (A260) allo

spettrofotometro (Jenway 6305 Uv/Vis, Spectrophotometer).

1.3 PCR

Negli esperimenti di PCR il cDNA è stato sintetizzato, a partire da 500 ng di RNA totale, utilizzando il kit Ready-To-Go RT-PCR Beads (Amersham Pharmacia Biotech). Ciascun

bead contiene la Trascrittasi Inversa del Virus della Leucemia Murina di Moloney

(MMLV) e la Taq DNA polimerasi con l’apposito buffer. Dopo aver sciolto il bead in acqua 0.1% DEPC, sono stati aggiunti i primers forward e reverse (25 μM ciascuno) e 0.5 μg di primer pd(N)6.

Il campione è stato incubato a 42°C per 30 minuti e poi, per inattivare la trascrittasi inversa e denaturarlo completamente, a 95°C per 5 minuti.

Le reazioni di PCR sono state eseguite utilizzando The MinicyclerTM Model PTC-150-16 (MJ Reserch, USA).

I primers utilizzati per controllare la qualità e la quantità dell’RNA, specifici per il gene della β-actina, sono indicati di seguito:

ACT1F : 5’-ACTGTGGGGCGCCCCAGGCACC-3’ ACT1R : 5’-CTCCTTAATGTGACGCACGATTTC-3’ Il programma utilizzato in questo caso è:

- denaturazione per 45 secondi a 94°C - annealing per 45 secondi a 55°C 35 cicli - estensione per 45 secondi a 72°C

- Estensione finale: 10 minuti a 72°

Sono stati poi utilizzati primers specifici per ciascun gene analizzato: TcRβ

Sono stati utilizzati dei primers specifici per la regione costante del TCRβ di Dicentrarchus

labrax, disegnati in base alla sequenza depositata nella banca on line NBCI (AJ493441). La

sequenza di tali primers, chiamati TR1 e TF1, è la seguente: TF1 5’–AGATTACCGGACCATCAGTGAAAG–3’ TR1 5’–TCAGTAGTTCTGCTTTCCCTTTGA–3’ Il programma utilizzato in questo caso è:

- denaturazione per 45 secondi a 94°C - annealing per 45 secondi a 58°C 35 cicli - estensione per 45 secondi a 72°C

- Estensione finale: 10 minuti a 72°C

CD8α

Sono stati utilizzati dei primers specifici per la regione costante del CD8α di Dicentrarchus

labrax, disegnati in base alla sequenza depositata nella banca on line NBCI (AJ846849). La

sequenza di tali primers, chiamati SBASS-CD8 F1 e REV1-CD8, è la seguente:

SBASSCD8 F1 5’-TACAGAGGCAATGAACTAAGATTCGG-3’ SBASSCD8REV1 5’-AGCCATCGTCCGCGGCTT-3’

Il programma utilizzato in questo caso è:

- denaturazione per 45 secondi a 94°C - annealing per 45 secondi a 54°C 35 cicli - estensione per 45 secondi a 72°C

CD4

Sono stati utilizzati dei primers specifici per la regione costante del CD4 di Dicentrarchus

labrax, disegnati in base alla sequenza depositata nella banca on line NBCI (AM849811).

La sequenza di tali primers, chiamati RQCD4FW e RQCD4RW, è la seguente: RQCD4FW 5’-CTGACCATCACCCCACTC-3’

RQCD4RW 5’-CTGAGGTGTGTCATCTTCC-3’

Il programma utilizzato in questo caso è:

- denaturazione per 45 secondi a 94°C - annealing per 45 secondi a 54°C 35 cicli - estensione per 45 secondi a 72°C

- Estensione finale: 10 minuti a 72°C

MHC II-β

Sono stati utilizzati dei primers specifici per la catena β dell’MHCII di Dicentrarchus

labrax, disegnati in base alla sequenza depositata nella banca on line NBCI (AY994059).

La sequenza di tali primers, chiamati MHCII-SBASR e MHCII-SBARV , è la seguente:

MHCII-SBASR: 5’-TCAGAGTGAGCTGGCTCAGA-3’ MHCII-SBARV: 5’-GGAACCAGAATCCTTCCTGG-3’

Il programma utilizzato in questo caso è:

- denaturazione per 45 secondi a 94°C - annealing per 45 secondi a 55°C 35 cicli - estensione per 45 secondi a 72°C

- Estensione finale: 10 minuti a 72°C

1.4 Elettroforesi del DNA su gel d’agarosio

La separazione e l'identificazione dei frammenti di DNA è stata effettuata mediante elettroforesi su gel d’agarosio, utilizzando un gel a diverse concentrazioni a seconda dei pesi molecolari delle bande da visualizzare.

Per la preparazione di un gel al 1% (w/v) si è preso: 1 g d'agarosio, disciolto in 100 ml di tampone TBE (0,89 M Tris-Borato, 20 mM EDTA, pH 8.3), utilizzato anche come tampone della corsa elettroforetica. Le molecole di DNA sono state identificate aggiungendo al gel Bromuro d'Etidio (10 ng/μl), una sostanza in grado d’intercalarsi fra le basi della doppia elica di DNA, rendendolo così visibile in seguito ad esposizione alla luce ultravioletta. Le elettroforesi sono state eseguite ad un voltaggio costante di 100 V, utilizzando l’apparato per elettroforesi Power-Pac 300 (BIO-RAD).

1.5 Procedure di clonaggio

I prodotti amplificati tramite le serie di PCR sono stati clonati e sequenziati per verificare l’effettiva specificità dei primers utilizzati.

1.5.1 Vettore utilizzato

Per il clonaggio in E. coli è stato utilizzato il vettore pGEM-T Easy (Promega) che ci ha permesso l’identificazione diretta dei trasformanti mediante Red-White screening in MacCONKEY Agar (Sigma) .

FIG. 1: MAPPA DEL VETTTORE