ANALISI STATISTICA

I risultati numerici sono stati espressi come la media ± SD. I dati ottenuti in seguito all’analisi d’espressione quantitativa, e alla conta delle cellule positive all’analisi d’immagine, sono stati analizzati attraverso l’analisi di varianza ad una coda o a due code (ANOVA), seguito dal test di comparazione multipla di Bonferroni, per determinare le differenze d’espressione tra i gruppi. Inoltre, l’analisi dei dati è stata compiuta utilizzando il software GraphPad Prism 3.0. Il livello di significatività accettato è stato p<0.05.

CAPITOLO III

RISULTATI

1. SVILUPPO DELL’ESPRESSIONE DEL TcRβ, CD8α, CD4 e MHCII-β NELLA SPIGOLA

L’attività di ricerca svolta durante il dottorato ha previsto come primo obiettivo di effettuare un’analisi dell’espressione di alcuni geni chiave coinvolti nello sviluppo di un sistema immunitario funzionale nella spigola, quali il TcRβ, CD8α, CD4 e MHCII-β. Per far questo, è stato estratto l’RNA totale da uova fertilizzate, da 3 pools (ciascuno di 50 animali) di larve (2, 4, 6, 8, 13, 16, 21, 25, 32 giorni post schiusa, ph), e post-larve (39, 51, 62, 75, 92 ph), e da timi di esemplari giovanili (1 anno di età) di spigola (Dicentrarchus

labrax L.). La concentrazione dell’RNA totale proveniente da ogni stadio è stata stimata

misurando l’assorbanza a 260 nm (A260) allo spettrofotometro (Jenway 6305 Uv/Vis,

Spectrophotometer). L’RNA estratto è stato utilizzato nella quantità di 0,5μg per la sintesi di molecole di cDNA per effettuare un’analisi d’espressione mediante RT-PCR. Infatti un parametro fondamentale per il confronto dei risultati della PCR semi quantitativa è la quantità di stampo presente in ciascuna reazione. Inoltre, al fine di standardizzare i risultati, in ogni reazione di PCR è stata utilizzata la stessa quantità di primers foward e reverse e sono stati effettuati lo stesso numero di cicli (35).

Per controllare la qualità e la concentrazione dell’RNA ottenuto, è stata fatta una serie di reazioni di RT-PCR, utilizzando primers specifici per il gene della β-actina, che è

costitutivamente espresso in tutte le cellule. Il prodotto ottenuto, di 550 bp, è risultato delle dimensioni attese (Fig. 3.1); questo passaggio è fondamentale per la normalizzazione dell’intensità delle bande e per evidenziare le reali differenze, dovute ad una variazione nell’espressione e non alla presenza di maggiore RNA.

Sono poi state fatte delle serie di reazioni di PCR utilizzando primers specifici per i singoli geni analizzati.

I primers utilizzati per il TCRβ sono stati disegnati per amplificare una regione di 550 bp della regione codificante il TcRβ di spigola. Come mostrato in figura 3.2A il TcRβ inizia ad essere rilevabile in larve di 25 giorni ph. Livelli crescenti di mRNA per il TcRβ sono stati osservati nei successivi stadi campionati, fino a raggiungere, in esemplari di 92 giorni ph, un’espressione paragonabile a quella del timo giovanile di spigola, utilizzato come

controllo positivo dell’esperimento. Per assicurarci della reale specificità dei nostri primers, la banda corrispondente al campione 25 giorni ph è stata purificata, clonata e sequenziata (Fig.3.2B). Tramite il programma “Expasy traslate” la sequenza nucleotidica è stata tradotta nella corrispettiva sequenza amminoacidica (Fig.3.2C). Attraverso i programmi “BLAST” e “ClustalW” si è confrontata la sua sequenza nucleotidica e aminoacidica con quelle presenti in banca dati provando, in modo definitivo, che si trattava di TcRβ di spigola (Fig.3.2D).

I primers utilizzati per il CD8α di spigola sono stati disegnati per amplificare una regione di circa 300 bp della sequenza codificante. Come si vede dalla Fig. 3.3A, il CD8α inizia ad essere rilevabile allo stadio di 51 giorni ph e la sua espressione aumenta fino allo stadio di 92 giorni ph. Il timo giovanile di spigola, che esprime il CD8α, è stato utilizzato come controllo positivo dell’esperimento. La specificità dei primers utilizzati è stata dimostrata mediante il clonaggio e il sequenziamento della banda corrispondente a 51 giorni ph (Fig.3.3B). Tramite il programma “Expasy traslate” la sequenza nucleotidica è stata tradotta nella corrispettiva sequenza aminoacidica (Fig.3.3C). Attraverso i programmi “BLAST” e “ClustalW” si è confrontata la sua sequenza nucleotidica e aminoacidica con quelle presenti in banca dati provando, in modo definitivo, che si trattava di CD8α (Fig.3.3D).

I primers utilizzati per lo studio dell’espressione del CD4 durante l’ontogenesi della spigola, amplificano una regione di circa 250 bp della sequenza codificante. La Fig.3.4A evidenzia che il trascritto, in maniera paragonabile all’espressione del CD8α, inizia ad essere rilevabile allo stadio di 51 giorni ph, per poi aumentare negli stadi successivi fino a quello di 92 giorni ph. Anche in questo caso il timo giovanile, che esprime il CD4, è stato utilizzato come controllo positivo dell’esperimento. Il successivo clonaggio e sequenziamento della banda a 51 ph ha permesso di verificare la specificità dei primers usati (Fig.3.4B). Tramite il programma “Expasy traslate” la sequenza nucleotidica è stata tradotta nella corrispettiva sequenza amminoacidica (Fig.3.4C). Attraverso i programmi “BLAST” e “ClustalW” si è confrontata la sua sequenza nucleotidica e aminoacidica con quelle presenti in banca dati provando, in modo definitivo, che si trattava di CD4 (Fig.3.4D).

I primers utilizzati per l’MHCII-β di spigola sono stati disegnati per amplificare una regione di 310 bp della sequenza codificante.

Come si vede dal gel (Fig.3.5A), l’mRNA per l’MHCII-β inizia ad essere rilevabile in animali di 4 giorni ph e livelli crescenti di mRNA sono stati osservati nei successivi stadi

campionati. Il timo giovanile di spigola, che esprime l’MHCII-β, è stato utilizzato come controllo positivo dell’esperimento. Per assicurarci della reale specificità dei nostri primers, la banda corrispondente a larve di 4 giorni ph è stata purificata clonata e sequenziata (Fig.3.5B). Tramite il programma “Expasy traslate” la sequenza nucleotidica è stata tradotta nella corrispettiva sequenza amminoacidica (Fig.3.5C). Attraverso i programmi “BLAST” e “ClustalW” si è confrontata la sua sequenza nucleotidica e aminoacidica con quelle presenti in banca dati provando, in modo definitivo, che si trattava di MHCII-β di spigola (Fig.3.5D).

Figura 3.1 Espressione del gene della β-actina durante lo sviluppo.

Esperimenti di RT-PCR con i primers specifici per il gene della β-actina sono stati compiuti su uova, larve e post larve di spigola campionate a diversi tempi dopo la schiusa. ph = post hatching

A)