Analisi funzionale degli effetti del chlorpyrifos sulle branchie di Carassius auratus

Per quanto riguarda l’analisi funzionale, nelle branchie di Carassius auratus, in seguito ad esposizione diretta a chlorpyrifos, l’espressione della pompa Na+_/K+_- ATPasi sembra essere strettamente collegata all’integrità strutturale dell’ILCM. Infatti, dopo esposizione alle due concentrazioni più basse (1 e 4 µg/L) l’espressione della proteina permane in parte sui livelli osservati negli esemplari di controllo mentre in seguito ad esposizione alla concentrazione più alta da noi testata (8 µg/L) si osserva una riduzione rilevante del segnale di immunomarcatura. Dopo il periodo di recupero in acqua priva di pesticida, parallelamente alla diminuzione del danno istopatologico, nelle branchie di Carassius auratus si osserva un aumento dell’espressione della Na+_/K+_-ATPasi.

In letteratura sono presenti diversi studi che descrivono l’espressione della Na+_/K+_{-ATPasi che non viene significativamente alterata o si mantiene costante} dopo esposizione acuta o cronica a fattori di stress; (Watson & Beamish, 1980; Watson & Benson, 1987; Wendelaar Bonga, 1997). In uno studio condotto sempre su Carassius auratus esposto a concentrazioni sub-letali di piombo, non sono stati osservati variazioni considerevoli dell’espressione di questo biomarker, mentre l’effetto inibitorio del metallo era molto più marcato per trasportatori Ca2+_-ATPasi (Franchini et al., 2009).

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118 Per quanto riguarda gli effetti sull’espressione di questa proteina in teleostei di acqua dolce esposti a inquinanti e successivamente trasferiti in acqua pulita, in letteratura esistono pochi dati e per di più contrastanti. In alcuni casi, è evidente che spostando gli esemplari in acqua priva di contaminate esiste una chiara tendenza a ritornare a condizioni paragonabili al controllo (De la Torre et al., 1999), mentre in altri casi l’inibizione permane (Verma et al., 1983; De la Torre et al., 2000). Tale variabilità nella risposta potrebbe essere determinata da una somma di cause dirette, come alterazioni della funzionalità e dell’integrità strutturale dell’epitelio di trasporto, e cause indirette, tra le quali il coinvolgimento del sistema endocrino (Hanke et al., 1983; Jensen, 2003). Inoltre, secondo De la Torre e collaboratori (2007) l’espressione della Na+_/K+_{-ATPasi è direttamente dipendente} dall’intensità del danno morfologico o funzionale causato dallo stress chimico, piuttosto che dalla sua tipologia (e.g. metalli pesanti, fenoli, nitriti o fosfati e pesticidi).

Dopo il periodo di esposizione diretta a chlorpyrifos, è stata osservata l’espressione dell’iNOS, che risultava assente in condizioni basali. Dopo il periodo di post esposizione in acqua priva di pesticida l’espressione della proteina è divenuta ancora più marcata.

Processi patofisiologici, come tumori, patogeni e la presenza di xenobionti causano un incremento dell’espressione dell’iNOS (Green et al., 1990; Liew et al., 1990; Nathan & Xie, 1994; Xiang & Rice, 2000; Cals-Grierson & Ormerod, 2004; Fenoglio et al., 2006, 2009).

L’espressione di questa proteina nei tessuti dei pesci indica l’innescarsi di un meccanismo di difesa che implica la produzione di ossido nitrico (Barroso et al., 2000). È noto che l’ossido nitrico coadiuva diversi processi tissutali, infatti, può sia indurre sia bloccare i fenomeni apoptotici (Melillo et al., 1995; Dimmeler & Zeiher, 1997; Palmer et al., 1998; Weller, 1999; Sollid et al., 2000), influire sulla proliferazione e la differenziazione delle cellule epidermiche (Bruch-Gerharz et al., 1998; Cals-Grierson & Ormerod, 2004) e intercedere nei processi riparativi (Witte & Barbul, 2002).

I dati presenti in letteratura riguardati l’espressione nell’iNOS evidenziano che tale proteina risulta maggiormente espressa dopo periodi di esposizione a pesticidi quali chlorpyrifos e l’atrazina nel cervello del pesce di acqua dolce

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Cyprinus carpio (Wang et al., 2013) e nel fegato di Carassius auratus gibelio esposto a

trichlorfon (Xu et al., 2011). In particolare, in esperimenti condotti su Oncorhynchus

mykiss infettato con Renibacterium, le branchie sono risultate l’organo in cui

l’incremento dell’espressione dell’iNOS è più veloce rispetto ad altri organi, come il fegato (Campos-Perez et al., 2000).

I dati che si riferiscono al periodo di post esposizione, invece sono contrastanti, infatti, alcuni autori riportano aumentati livelli della proteina in seguito a post esposizione in acqua priva di pesticida (Wang et al., 2013), altri riportano un decremento della stessa (Kim et al., 2005). L’incremento dell’iNOS dopo il periodo di trattamento con chlorpyrifos, può indicare, quindi, l’insorgenza di processi di proliferazione cellulare al fine di ripristinare gli elementi cellulari danneggiati dalla precedente presenza del contaminante (Bernabò et al., 2013).

Per quanto riguarda l’analisi da noi effettuata sullo stato di lipoperossidazione indotto da un’esposizione a chlorpyrifos, i nostri risultati hanno mostrato chiaramente un incremento rilevante dello stress ossidativo a tutte e tre le concentrazioni da noi testate dopo 96 ore di esposizione. Dopo il periodo di post esposizione in acqua priva di pesticida, negli esemplari esposti alle due concentrazioni più basse, 1 e 4 µg/L, il livello di lipoperossidazione è statisticamente comparabile a quello osservato negli animali mantenuti in condizioni basali; al contrario, negli individui esposti alla concentrazione di 8 µg/L, anche dopo il periodo di post esposizione permane una differenza statisticamente significativa rispetto al gruppo di controllo.

La lipoperossidazione è un fenomeno che può essere indotto dalla presenza di xenobionti, come pesticidi e metalli, in ambiente acquatico (Khrer, 1993; Basini et al., 2012; Jin et al., 2012). Nell’organismo esistono degli enzimi che mantengono l’equilibrio fisiologico fra la produzione e l’eliminazione di specie chimiche ossidanti, ma questi risultano efficienti entro definiti range di valori. Quando i livelli di perossidi e radicali liberi superano questi limiti, infatti, si manifestano gli effetti tossici che causano danno a tutti i componenti della cellula, incluse proteine, lipidi ed acidi nucleici (Ahmad et al., 2000).

È stato dimostrato che il chlorpyrifos, così come altri pesticidi, causa un incremento dello stress ossidativo in Cyprinus carpio dopo periodi brevi di esposizione (Xing et al., 2012b); mentre in Carassius auratus esposto a ritardanti di

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120 fiamma bromurati è stata evidenziata un’inibizione degli enzimi antiossidanti e, parallelamente, un incremento della lipoperossidazione (Feng et al., 2013).

Nel nostro studio abbiamo rilevato che in Carassius auratus, dopo esposizione a chlorpyrifos, la lipoperossidazione dei tessuti branchiali è strettamente correlata alla presenza di danni istologici; risultati simili sono stati riportati per la stessa specie dopo esposizione acuta a tetrabromobisphenol A (Shi et al., 2005), e in Gobiocypris rarus dopo esposizione cronica a tetrabromobisphenol A e decabromodiphenylethane (Zhang et al., 2008). L’accumulo delle specie chimiche ossidanti in condizioni di stress chimico, infatti, altera la composizione e la struttura delle membrane lipidiche provocando un iniziale danno ossidativo ai costituenti della cellula e, successivamente, danno all’intera struttura cellulare (Esterbauer et al., 1990; Monteiro et al., 2000).