Espressione di proteine target nelle branchie di Thalassoma pavo esposte a piombo

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57 L’osservazione in microscopia confocale del pattern di immunomarcatura della pompa Na+_/K+_{-ATPasi rivela che in condizioni basali tale proteina è espressa,} nella porzione interlamellare del filamento principale, esclusivamente a livello delle chloride cells; la fluorescenza mette in evidenza l’ampio corpo cellulare di tale tipologia cellulare (Tav. 8, figg. A-B).

Dopo esposizione ad 800 µg/L di nitrato di piombo, è ancora possibile notare un’espressione della proteina sempre a livello delle chloride cells comparabile a quanto osservato negli esemplari di controllo (Tav. 9, figg. A-B). Una lieve diminuzione del pattern di espressione della proteina è invece riscontrabile dopo 96 ore di esposizione al metallo considerato (Tav. 9, figg. C-D), che diventa ancora più pronunciata dopo 192 ore di esposizione; infatti, è possibile osservare che il segnale diminuisce ulteriormente rispetto agli esemplari di controllo (Tav. 9, figg. E-F).

Dopo 48 ore di esposizione a 2000 µg/L di nitrato di piombo, l’espressione della Na+_/K+_{-ATPasi nelle branchie di Thalassoma pavo risulta diminuita rispetto a} quanto si osserva negli esemplari di controllo (Tav. 10, figg. A-B); all’aumentare dei tempi di esposizione, ovvero dopo 96 e 192 ore, è possibile notare che la proteina mantiene livelli di espressioni più bassi rispetto al gruppo di controllo (Tav. 10, figg. C-F).

Dopo 48 ore di esposizione a 12000 µg/L di nitrato di piombo, l’espressione della Na+_/K+_{-ATPasi appare ancora comparabile a quanto osservato nel gruppo di} controllo (Tav. 11, figg. A-B). Al contrario, dopo 96 ore è possibile notare una marcata down regolazione della sua espressione; il segnale immunofluorescente a livello del filamento primario, infatti, è quasi assente (Tav. 11, figg. C-D). Dopo 192 ore di esposizione, invece, è possibile notare nuovamente una lieve espressione della Na+_/K+_{-ATPasi sempre a livello delle chloride cells (Tav. 11, figg. E-F).}

5.3.2. Acquaporina 3

Nell’epitelio branchiale di Thalassoma pavo, l’AQP-3 è espressa nel filamento principale a livello delle chloride cells (Tav. 8, fig. C-D).

Dopo 48 di esposizione a 800 µg/L di nitrato di piombo, il pattern di espressione della AQP-3 risulta invariato e comparabile a quanto osservato negli esemplari di controllo (Tav. 12, figg. A-B). Al contrario, dopo 96 ore è possibile notare una lieve decremento dell’espressione della proteina (Tav. 12, figg. C-D), che risulta ancora più marcato dopo 192 ore di trattamento (Tav. 12, figg. E-F),

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58 Dopo 48 e 96 ore di esposizione a 2000 µg/L di nitrato di piombo, l’espressione dell’AQP-3 risulta diminuita rispetto al gruppo di controllo (Tav. 13, figg. A-D). Al contrario, dopo 192 ore di trattamento il segnale di immunomarcatura relativo alla proteina appare lievemente aumentato (Tav. 13, figg. E-F).

Dopo 48 ore di esposizione a 12000 µg/L a nitrato di piombo il pattern di espressione della proteina AQP-3 si mantiene paragonabile a quello osservato negli esemplari di controllo (Tav. 14, figg. A-B). Dopo 96 ore, invece, le regioni immunoreattive sono scarsissime: è possibile notare limitate regioni fluorescenti in corrispondenza delle cellule accessorie (Tav. 14, figg. C-D). Al termine delle 192 ore di trattamento, il segnale appare nuovamente a livello delle chloride cells (Tav. 14, figg. E-F).

5.3.3. Metallotioneine

Le osservazioni eseguite in microscopia confocale rivelano l’assenza dell’espressione delle MTs nelle branchie degli esemplari di controllo di Thalassoma

pavo (Tav. 8, figg. E-F).

Già dopo 48 ore di esposizione a 800 µg/L di nitrato di piombo è possibile notare un incremento dell’immunoreattività relativa alle MTs soprattutto a livello delle regioni interlamellari (Tav. 15, figg. A-B). Dopo 96 ore, il pattern di espressione è rilevabile anche a livello delle lamelle secondarie (Tav. 15, figg. C-D). Al termine delle 192 ore di esposizione, l’espressione delle MT risulta ancora più intensa, ed il segnale è rilevabile in maniera marcata sia nell’epitelio primario che in quello secondario (Tav. 15, figg. E-F).

Le MTs mostrano una marcata e uniforme espressione che interessa tutto il tessuto branchiale di Thalassoma pavo, in tutti i tempi di esposizione dopo trattamento con 2000 µg/L di nitrato di piombo (Tav. 16, figg. A-F). Stesso pattern di espressione è rilevabile negli esemplari esposti a 12000 µg/L di nitrato di piombo dopo tutti i tempi di esposizione; in particolare, è possibile notare che la proteina è espressa in maniera più marcata nelle aree che presentano maggiore danno strutturale (Tav. 17, figg. A-F).

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5.4. Struttura ed ultrastruttura delle branchie di Thalassoma pavo

esposte a chlorpyrifos

5.4.1. Esposizione a 3.5 µg/L di CPF

Le branchie di Thalassoma pavo esposte alla concentrazione di 3.5 µg/L di chlorpyrifos dopo 48 ore mostrano severe e numerose alterazioni sia a livello del filamento primario, che secondario. In particolare, le sezioni istologiche mostrano aree iperplastiche a livello del filamento primario, un notevole incremento delle dimensioni delle chloride cells e la fusione delle lamelle secondarie (Tav. 18, figg. A-B). L’osservazione al MO ha permesso anche di rilevare un marcato fenomeno di lifting dell’epitelio secondario (Tav. 18, fig. C), mentre la formazioni di aneurismi che coinvolge la porzione distale delle lamelle è chiaramente osservabili anche a livello ultrastrutturale (Tav. 18, fig. D).

Dopo 96 ore di esposizione, sia il filamento primario che secondario sono interessati da numerose e intense alterazioni. Al MO la struttura branchiale appare notevolmente disorganizzata e interessata da fenomeni degenerativi delle componenti cellulari (Tav. 19, figg. A-B). L’osservazione al TEM consente, inoltre, di notare la marcata degenerazione delle cellule epiteliali e basali del filamento secondario (Tav. 19, figg. C-D).

5.4.2. Esposizione a 7 µg/L di CPF

Le branchie di Thalassoma pavo dopo 48 ore di esposizione a 7 µg/L di chlorpyrifos, subiscono gravi alterazioni soprattutto a carico delle lamelle secondarie. Le immagini al MO rivelano il fenomeno di lifting dell’epitelio primario e secondario (Tav. 20, fig. A), mentre nelle lamelle secondarie la componente vascolare è seriamente compromessa a causa della completa degenerazione delle cellule basali (Tav. 20, fig. B). In seguito ad esposizione al chlorpyrifos, inoltre, le chloride cells non sono più localizzate esclusivamente nei filmanti principali, ma si collocano lungo i margini inferiori delle lamelle secondarie (Tav. 20, figg. C-D). Le immagini al TEM confermano, sempre nelle lamelle secondarie, i marcati fenomeni degenerativi delle cellule pavimentose e di quelle basali (Tav. 20, figg. E-G).

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60 Dopo 96 ore di esposizione, le lamelle secondarie presentano un andamento estremamente irregolare (Tav. 21, fig. A). Al MO è possibile notare la fusione delle lamelle originate da filamenti adiacenti (Tav. 21, fig. B), congiuntamente alla presenza di lifting e ipertrofia delle cellule dell’epitelio secondario (Tav. 21, fig. C). A livello ultrastrutturale si nota la presenza di aneurismi (Tav. 21, fig. D), e l’intensa degenerazione a livello cellulare sia nel filamento principale (Tav. 21, fig. E) che in quello secondario (Tav. 21, fig. F).

5.5. Espressione della Na

/K

-ATPasi nelle branchie di Thalassoma