Analisi microbiologiche

5.2.1. Preparazione dei campioni

Per tutte le analisi microbiologiche, salvo la ricerca di L.monocytogenes, un campione di 25 g prelevato sterilmente da ciascuna unità di

prodotto, sia per la materia prima che per il prodotto finito ai diversi tempi di conservazione, è stato addizionato a 225 ml di Maximum Recovery Diluent (MRD) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) e poi omogeneizzato in Stomacher 400 Circulator (PBI International, Milano-Italia) per 30 secondi.

A a ti e a ’omogeneizzato, che rappresenta la diluizione 1:10, sono state allestite, con il medesimo diluente, le ulteriori diluzioni seriali in base 10.

5.2.2. Carica batterica mesofila totale e Carica batterica psicrofila totale

La CBTm e la CBTp sono state eseguite tramite semina per inclusione di 1 ml di ciascuna diluizione in terreno PCA (Plate Count Agar) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK).

Le piastre sono state poste ad incubare a 30° C per 3 giorni nel caso della CBTm e a 7°C per 10 giorni per la CBTp.

A te mine e ’incu a ione tata e e uita a

conta delle colonie prendendo in

considerazione la diluizione che, seminata sulle piastre, ha dato luogo alla crescita di colonie in numero compreso tra 30 e 300.

Fig. 9 - Piastre Petri con PCA in solidificazione

37 5.2.3. Determinazione quantitativa dei batteri lattici

La determinazione quantitativa dei batteri lattici è stata eseguita tramite semina per inclusione di 1 ml di ciascuna diluizione in terreno Man Rogosa Sharpe (MRS) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK), che permette la crescita indistinta di tutti i batteri lattici. Le piastre sono state poste ad incubare in anaerobiosi a 25° C per 3 giorni.

Le colonie tipiche dei batteri lattici si presentano come bianche, grandi e lenticolari. Al te mine e ’incu a ione tata e e uita a conta ei atte i attici en en o in considerazione la diluizione che, seminata sulle piastre, ha dato luogo alla crescita di colonie in numero compreso tra 30 e 300.

5.2.4. Determinazione quantitativa delle Enterobacteriaceae

La determinazione quantitativa delle Enterobacteriaceae è stata eseguita tramite semina per spatolamento di 0.2 ml di ciascuna diluzione su terreno Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK), seguita da incubazione a 37° C per 1-2 giorni Il VRBGA è un terreno selettivo e differenziale per la conta delle Enterobacteriaceae, nato dalla modifica del Violet Red Bile Agar; al posto del lattosio contiene infatti glucosio, che viene fermentato da tutte le specie appartenenti a questa famiglia, e quindi non permette di differenziare i lattosio fermentanti dai non fermentanti. Anche in questo terreno l’a ione selettiva è svolta dai sali biliari e dal cristal violetto che inibiscono la crescita dei gram positivi e dei microrganismi non di origine enterica.. Le colonie sono quindi rosso scure con o senza un alone rossastro di precipitazione dei sali biliari. La conta delle Enterobacteriaceae è stata eseguita prendendo in considerazione la diluizione che, seminata sulle piastre, ha dato luogo alla crescita di colonie in numero compreso tra 30 e 300.

38 5.2.5. Determinazione quantitativa di Escherichia coli

Per la determinazione quantitativa di E. coli si è ricorso alla semina per spatolamento superficiale di 0.2 ml di ciascuna diluizione su terreno Tryptone Bile X-glucoronide (TBX) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK). Il TBX è un terreno selettivo e cromogenico sul quale le colonie di E. coli appaiono blu o verdi-blu. L’a ione e etti a i ta e te eno o uta come nel caso del VRBGA, alla presenza dei sali biliari, che inibiscono la crescita dei gram positivi, ment e ’a ione iffe en ia e o ta a u t ato c omo eno X-GLUC (5-bromo-4-cloro-3 indolil-β-D-glucuronide) il quale può essere idrolizzato da E. coli, a ie a ’en ima ß- glucuronidasi, con la produzione di un pigmento blu-verde.

Una volta seminate, le piastre sono state incubate a 44° C per 1-2 giorni.

Le colonie di E. coli appaiono di colore blu- e e con ’ecce ione i alcuni ceppi che non presentano la ß-glucuronidasi, come il ceppo O157:H7, che quindi cresce in colonie bianche. La determinazione quantitativa di E.coli è stata eseguita prendendo in considerazione la diluizione che, seminata sulle piastre, ha dato luogo alla crescita di colonie in numero compreso tra 30 e 300.

5.2.6. Conta dei microrganismi produttori di H2S

Per la ricerca dei produttori di H2S, è stata eseguita la semina per inclusione di 1 ml di

ciascuna diluizione in Iron Agar (IA) (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) incubate a 25°C per 3 giorni. La presenza del solfato di ferro permette di evidenziare la presenza dei microrganismi che crescono in colonie nere perché riducono il solfato a solfuro di ferro di colore nero. La conta dei microrganismi produttori di H2S è stata eseguita prendendo in considerazione la

diluizione che, seminata sulle piastre, ha dato luogo alla crescita di colonie in numero compreso tra 30 e 300.

39 5.2.7. Ricerca di Listeria monocytogenes

La ricerca di L. monocytogenes è stata effettuata su un campione di 25 g costituito a partire dalle 3 unità di prodotto per ciascun tempo di conservazione seguendo la metodica, validata AFNOR, che prevede un unico arricchimento a 30°C per 24 ore, per il quale è stato utilizzato ’Oxoi No e En ic ment (ONE B ot -Listeria + supplemento selettivo, seguito da semina in terreno cromogeno selettivo differenziale ALOA agar (Agar Listeria secondo Ottaviani & Agosti) (Biolife, Milano, Italia) e incubazione a 37° C per 1-2 giorni. Nel caso in cui, dopo tale periodo, si evidenzi la presenza di colonie di L.monocytogenes, si esegue la determinazione quantitativa.

L’ALOA a un’a ione e etti a a ie a a e en a e itio c o u o e della miscela antimicrobica del supplemento selettivo contenente ceftazidime, polimixina B, acido nalidissico e cicloeximide. E’ inoltre un mezzo differenziale grazie alla presenza del composto cromogenico X- uco i e c e uò e e e attaccato a ’en ima ß-glucosidasi, presente in tutte le specie di Listeria e al composto L-α- fosfatidilinositolo che viene attaccato dalla fosfolipasi C propria della L. monocytogenes.

Le colonie di L. monocytogenes su terreno ALOA appaiono quindi colorate di verde-blu con alone opaco intorno, mentre le altre specie di Listeria sono verdi-blu senza alone.

5.2.8. Calcolo delle ufc/g

Alla fine del periodo di incubazione sono state contate le colonie per ogni piastra ed è stato eseguito il calcolo delle ufc/g di prodotto come segue:

______ C_____ V . (n1+0.1 n2) . d

Dove:

40 V i o ume e ’inocu o eminato;

n1 è il numero di piastre della prima diluzione; n2 è il numero di piastre della seconda diluizione; d è il fattore di diluizione della prima diluizione.