Analisi molecolari

Le analisi molecolari sono state effettuate per la ricerca di Giardia su aliquote fecali congelate; l’iter di lavorazione prevede: l’estrazione di DNA dai campioni, la Nested PCR, e la corsa elettroforetica su gel di acrilammide. Ogni campione risultato positivo poi è stato sequenziato per identificare il genotipo e la specie di Giardia individuata.

Estrazione del DNA

Per estrarre il DNA dai campioni fecali congelati è stato utilizzato il kit commerciale PSP^® Spin Stool DNA PLUS- Hoffmann-LaRoche Inc. Il protocollo prevede le seguenti fasi:

- si trasferisce una parte di ogni campione in una provetta da 2 ml con 1 ml circa di Stool stabilizer (permette di mantenere stabile il DNA);

- si incubano i campioni a 95°C per 10 minuti in un termomixer (vedi foto) in movimento a 900 rpm, ciò serve ad aumentare la quantità di DNA presente per la distruzione delle pareti cellulari;

- si centrifugano i campioni a 14000 rpm per 1 minuto per dividere le parti solide dalle liquide;

- si trasferisce completamente il surnatante in una provetta “Invi-Adsorbe” fornita dal kit;

- si agita vigorosamente per 15 secondi; si incuba la sospensione a temperatura ambiente per 1 minuto, poi si centrifuga a 14000 rpm per 3 minuti;

- si trasferisce il surnatante completamente in una provetta da 1,5 ml; si centrifuga nuovamente a 14000 rpm per 3 minuti;

- si trasferiscono 800 µl del surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e si aggiungono 25 µl di proteinasi K; si agita brevemente e si incuba per 10 minuti nel termomixer a 70°C a 900 rpm;

- si aggiungono 400 µl di Binding Buffer P e si agita brevemente;

- si preparano delle nuove provette da 2 ml con uno Spin filter (per trattenere il DNA) e si trasferiscono 700 µl di lisato, precedentemente ottenuto; si incuba a temperatura ambiente per 1 minuto e si centrifuga a 12000 rpm per 1 minuto; - si elimina la soluzione filtrata, si aggiungono 500 µl di Wash Buffer I, si centrifuga

a 12000 rpm per 1 minuto;

- si elimina la soluzione filtrata, si aggiungono 800 µl di Wash Buffer II, si centrifuga a 12000 rpm per 1 minuto;

- si elimina la soluzione filtrata e si ricentrifuga a 14000 rpm per 3 minuti per eliminare completamente l’etanolo;

- si pone lo Spin Filter in una nuova provetta da 1,5 ml, si aggiungono 200 µl di Eluition Buffer D (preriscaldato a 70°C), si incuba a temperatura ambiente per 3 minuti;

- si centrifuga nuovamente a 8000 rpm per 1 minuto per staccare il DNA dal filtro e si elimina lo Spin Filter.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

L’aliquota congelata di ogni campione raccolto è stata analizzata mediante una tecnica di biologia molecolare identificata come Nested PCR (PCR annidata), questa è un tipo di PCR che prevede l’utilizzo di due coppie di primer in due PCR consecutive; nella prima PCR, viene usata una coppia di primer e viene amplificato il segmento bersaglio. I prodotti di questa prima PCR, vengono quindi usati per allestire una seconda PCR. In questa seconda reazione, i primer utilizzati sono diversi dai primi e sono sequenze ottenute completamente nel segmento bersaglio precedentemente amplificato. Questo tipo di PCR aumenta la sensibilità del metodo utilizzando nella seconda PCR del DNA già amplificato ed inoltre aumenta la specificità dell’amplificazione del DNA, riducendo l’amplificazione di DNA aspecifico.

Il vantaggio della Nested PCR è l’aumentata sensibilità e specificità del metodo rispetto alla PCR convenzionale. Gli svantaggi maggiori sono i tempi necessari per l’allestimento e l’elevato rischio di contaminazioni.

I primer scelti sono rappresentati dal gene 18S-rRNA, questa codifica per la piccola subunità ribosomiale 18S e permette di distinguere i maggiori assemblaggi genetici (A-G) di G. duodenalis.

Per la prima amplificazione del gene 18S-rRNA è stato usato il primer forward RH11 [5’-CAT CCG GTC GAT CCT GCC-3’] ed il primer riverse RH4 [5’-AGT CGA ACC CTG ATT CTC CGC CAG G-3’] che amplificano una regione di 292 bp (Hopkins et al, 1997). Per la seconda amplificazione è stata amplificata da RH11 e RH4: GIAR-F (forward) [5’-CAG GCT CTC CCC AAG GAC-3’] e GIAR-R (reverse) [5’-CTG CGT CAC GCT GCT CG-3’] che amplificano un frammento di 175 bp (Read et al, 2002).

Nella prima reazione di amplificazione del gene 18S-rRNA, la composizione della miscela di reazione per un singolo campione, con volume finale di 25 µl, è la seguente:

2 µl di DMSO;

2,5 µl di Buffer 10X; concentrazione finale 1X;

0,5 µl di dNTPs 10 mM; concentrazione finale 0,2mM;

1 µl di ciascun primer (RH11 e RH4) 10 µl; concentrazione finale 0,4 µM; 0,4 µl di AmpliTaq Gold^® corrispondente a 2 U;

4 µl di DNA;

Acqua, quanto basta per raggiungere il volume finale di 25 µl.

Per la seconda amplificazione è stato utilizzato 1 µl di amplificato della prima PCR, 1 µl dei primer GIAR-F e GIAR-R (concentrazione finale 0,4 µM), mentre rimangono invariate le concentrazioni finali degli altri componenti della miscela di reazione.

Nella preparazione della miscela di reazione, è sempre prevista la presenza di un controllo negativo, costituito da acqua sterile, per verificare l’assenza di contaminazioni, e un controllo positivo, rappresentato da un campione di cui si conosce essere presente il target, che funge da controllo del processo.

Le condizioni di amplificazione usate nella prima PCR e nella seconda sono identiche e consistono in una prima fase a 94°C per 11 minuti e 30 secondi (attivazione dell’AmpliTaq Gold) seguita da:

- 94°C per 30’secondi; - 65°C per 30 secondi; - 72°C per 30 secondi;

Ed estensione finale a 72°C per 7 minuti.

Elettroforesi

I prodotti di amplificazione sono stati separati mediante corsa elettroforetica in gel di acrilammide al 7% e successivamente evidenziati mediante colorazione del gel con syber-safe, osservato poi mediante un transilluminatore a luce ultravioletta collegato al computer grazie al programma Quantity One, 1-D Analysis software.

Il gel è stato preparato mescolando: 8,93 ml di acrilammide 7%, 42 µl di APS (persolfato di ammonio) e 21 µl di TEMED (tetrametietilendiammina); dopo aver aspettato che solidificasse è stato caricato sulla vaschetta per la corsa elettroforetica.

Un’aliquota di 8 µl del prodotto di amplificazione è stata miscelata con 3 µl di 6X Loading Dye Solution (Fermentas) e caricata all’interno di un singolo pozzetto.

Per valutare le dimensioni degli amplificati sono stati utilizzati 5 µl di GeneRuler^TM 8 bp DNA, o GeneRuler^TM 100bp Ladder, caricati anch’essi in gel.

Le condizioni di corsa adottate prevedevano un voltaggio costante a 200 V per 45 minuti; al termine il gel è stato immerso in una soluzione tampone contenente Syber-Safe, indispensabile per vedere le bande.

Sequenziamento

I campioni risultati positivi alle analisi molecolari per la ricerca di Giardia spp. sono stati inviati alla BMR-Genomics di Padova per essere sequenziati mediante ABPRISM 3700 (Applied Biosystems).

Le sequenze ottenute sono state poi allineate mediante ChromasPro (versione 1.42) e confrontate con quelle presenti in GenBank, utilizzando BLAST, al fine di valutare l’identità delle sequenze.