Analisi di parentela

Per confermare la classificazione dei campioni nelle otto famiglie half-sib è stata effettuata l’analisi di maternità sulle otto piante madri J. nigra mediante il metodo ad esclusione. Tale metodo si basa sulle normali leggi di segregazione Mendeliane ed è attuabile quando si hanno a disposizione marcatori altamente polimorfici come gli SSRs. La maternità è stata definitivamente assegnata quando almeno un allele di origine materna era presente nella progenie in ogni locus per i dieci loci microsatellitari totali.

L’analisi di paternità su ogni “figlio” ibrido diploide identificato (cioè assegnare il più probabile padre J. regia ad una coppia geneticamente nota, in questo caso “madre J. nigra e figlio J. x intermedia”) è stata eseguita mediante il software CERVUS ver. 2.0 (Marshall et al., 1998), un programma basato sul metodo “Most likelihood” (Meagher, 1986). In generale l’analisi di

paternità mediante SSRs può fornire tre possibili risultati (fig. 24). Se l’analisi ad esclusione, basata sulla probabilità di segregazione date dalle leggi di Mendel esclude tutti i potenziali padri tranne uno, la paternità viene assegnata (fig. 24a). Se tutti i potenziali padri vengono esclusi si ipotizza un’impollinazione esterna (fig. 24c).

Figura 24. Leonardi S., 2005. Dispense di ecologia vegetale, Università di Parma. Possibili risultati dell’analisi di paternità.

Se invece più di un potenziale padre non può essere escluso è necessario assegnare la paternità ad uno dei potenziali padri non esclusi (fig. 24b).

Perciò in questo studio l’aplotipo del potenziale padre è stato dedotto sottraendo il contributo materno dal genotipo multilocus della pianta figlio. L’aplotipo paterno così ottenuto è stato poi comparato sia con tutti i possibili aplotipi corrispondenti alle 49 piante adulte J. regia presenti nel Parco di Villa Mezzalira, sia con lo stesso genotipo materno per determinare una eventuale auto-fecondazione. In presenza di più possibili padri non esclusi, si è assegnata la paternità al padre con il valore LOD (LOD score o loge-likelihood ratio) più alto (Most Likelihood approach, Meagher, 1986). Indicando con go, gm, e ga, il genotipo del figlio (offspring), della pianta madre (mother) e del padre putativo (alleged father) in un dato locus rispettivamente, la probabilità che il padre putativo sia il vero padre è data dalla seguente formula (Aitkin, 1995)

Likelihood ratio = L(H1,H2 | go, gm, ga ) = T (go | gm, ga) / T (go | gm)

indicando con T (go | gm, ga) la probabilità di ottenere il genotipo go, data la madre gm, ed il padre putativo ga (leggi di segregazione di Mendel) e con T (go | gm) la probabilità che un gamete della madre si incroci con un gamete preso a caso dalla popolazione per dare il genotipo go. In altre parole la likelihood ratio misura la probabilità che il padre putativo abbia passato il gamete al figlio, rispetto ad un maschio preso a caso dalla popolazione (fig. 25).

Figura 25. Marshall et al., (1998).

Likelihood ratio [L(H1,H2] per tutte le possibili combinazioni madre(mother) – figlio (offspring) - padre putativo (alleged father). X rappresenta un qualsiasi allele diverso da B, Y un qualsiasi allele diverso sia da B che da C. Le frequenze dell’allele B e C sono indicate con b e c.

Il LOD score è il logaritmo naturale del valore ottenuto moltiplicando i likelihood ratio di tutti i loci. Se due padri putativi hanno un LOD uguale, non è possibile attribuire la paternità. Nel caso di marcatori non sufficientemente polimorfici, questa ultima evenienza si presenta piuttosto spesso. Poiché i livelli di significatività statistica per i LOD score non possono essere derivati analiticamente, Marshall et al., (1998) hanno definito per questo fine la statistica Δ. Il valore Δ corrisponde alla differenza in LOD score tra il padre più probabile ed il secondo padre più probabile. Se indichiamo con n il numero di padri putativi non esclusi avremo:

Δ = non definito n = 0 ( tutti i padri putativi esclusi, impollinazione esterna) Δ = LOD1 n = 1 (un solo padre putativo non escluso)

Δ = LOD1 – LOD2 n > 1 ( due o più padri putativi non esclusi)

Basandosi sulle frequenze alleliche osservate, il programma CERVUS genera una combinazione madre-padre-figlio e un set di maschi candidati non imparentati per 10.000 volte. Per ogni simulazione calcola il corrispondente valore Δ fino ad ottenere due distribuzioni di Δ, ”Most- likely fathers” e “Most-likely nonfathers” (fig. 26).

Il programma confronta i casi in cui il padre più probabile sia il vero padre e quelli in cui invece il padre più probabile sia un maschio preso a caso dalla popolazione. Il livello di confidenza sarà quel valore critico di Δ, ottenuto mediante simulazioni, che se usato fornisce una percentuale di falsi positivi (cioè assegnazione di un padre che in realtà non è imparentato) del 1:5 per l’80% (relaxed confidence) e del 1:20 per il 95% (strict confidence).

Figura 26. Marshall et al., (1998).

Le due distribuzioni di Δ, ”Most-likely fathers” e “Most-likely nonfathers” ottenute mediante 10.000 simulazioni su cui calcolare il valore critico Δ per i due livelli di confidenza 80% (relaxed confidence) e 95% (strict confidence).

Nel presente studio è stata fatta l’assunzione che non vi siano errori di genotyping e che la frequenza di mutazione tra genitori e figli nei loci microsatellitari sia trascurabile. Inoltre individuati eventuali errori di campionamento, la maternità è stata ri-assegnata combinando il metodo ad esclusione con il Most Likelihood approach. Non avendo alcuna informazione sulla pianta madre, la probabilità che il genotipo putativo ga sia un genitore per il genotipo figlio go è stata calcolata con la seguente formula (Marshall et al., 1998):

Likelihood ratio = L(H1,H2 | go, ga ) = T (go | ga) / T (go)

indicando con T (go | ga) la probabilità di ottenere il genotipo go, data il genitore putativo ga, e con T (go) la probabilità di generare il genotipo figlio nella popolazione.

Infine, due distinte probabilità d’esclusione parentale sono state calcolate per ogni locus e per tutti i loci mediante il software CERVUS: 1) Esclusion probability second parent (EP2) corrispondente alla probabilità che un maschio non imparentato, campionato a caso nella popolazione, sia escluso come donatore di polline nell’analisi di paternità con madre nota, 2) Esclusion probability first parent (EP1) corrispondente alla probabilità che una pianta non imparentata, campionata a caso nella popolazione, sia esclusa come potenziale genitore del genotipo figlio.

3. 2 .6. Pattern d’impollinazione

Per ogni progenie sono state misurate le distanze (metri) tra la pianta madre J. nigra e tutti i padri J. regia assegnati, allo scopo di comprendere se il successo riproduttivo maschile fosse influenzato dalla disposizione spaziale degli alberi nel sito. Per comparare le distanze medie d’impollinazione tra le piante madri ibridogene J. nigra è stato usato il test non parametrico di Kruskal-Wallis mentre per individuare eventuali correlazioni statistiche tra il numero di successi riproduttivi e la distanza tra ogni pianta madre J. nigra e il padre J. regia assegnato è stato calcolato il coefficiente di correlazione di Spearman (XLSTATS software, Rodney-Carr 1997- 2005).

3. 3. Risultati