Analisi statistica

Per l’esecuzione dell’analisi statistica è stato utilizzato il software MedCalc®.

Tuti i dati sono stati sottoposti alla verifica delle assunzioni di normalità di distribuzione utilizzando Shapiro-Wilk test.

È stato effettuato il t-test per la comparazione dei risultati ottenuti con il BAT tra i soggetti positivi (IgE specifiche con clinica) e i soggetti negativi (controllo). Un’altra comparazione eseguita è stata quella tra l’attivazione dei basofili ottenuta con gli estratti di A. pegreffi e quella con gli estratti di A. simplex s. s.

36 4. RISULTATI

Le larve di Anisakidae isolate dalle due specie ittiche Lepidopus caudatus (pesce sciabola) e Clupea harengus (aringa) sono state identificate a livello di genere come Anisakis di tipo I (sensu Berland) mediante identificazione morfologica al microscopio ottico . I profili delle bande di restrizione ottenuti con la PCR-RFLP hanno permesso di identificare le larve isolate da Lepidopus caudatus (pesce sciabola) come A. pegreffii e le larve isolate dalla specie Clupea harengus (aringa) come A. simplex s.s.

Le indagini preliminari (ispezione visiva) e molecolari pertanto hanno confermato queste due specie ittiche, la prima del Mar Mediterraneo, la seconda proveniente dall’Atlantico settentrionale, come più utili (tra l’altro maggiormente infestate) per il reperimento delle larve, rispettivamente di A. pegreffii e A. simplex s.s., per la messa a punto del protocollo di estrazione di proteine. Il metodo di estrazione degli allergeni è stato ottimizzato per un valore di larve iniziale fra 50 e 80; tale numero di larve si è rivelato il più congruo al fine di ottenere un estratto ad alte concentrazioni con una ridotta presenza di interferenti. Ciascun soggetto afferente all’ambulatorio di allergologia durante il periodo di studio, è stato sottoposto ad un’anamnesi completa, incluse le abitudine alimentari ed eventuali altre allergie. Le informazioni fornite dai pazienti ambulatoriali con la compilazione del questionario, sono state registrate su un foglio excel per raccogliere tutti i dati utili allo studio. Sono state prese in considerazione le manifestazioni cliniche riconducibili a reazioni di natura allergica (asma, rinite, congiuntivite, orticaria/angioedema, dolore addominale, diarrea, vomito o anafilassi) oltre a età, sesso, residenza, posizione lavorativa, uso di DPI.

Come detto in precedenza, tutti i soggetti sono stati sottoposti inizialmente allo SPT in vivo e al dosaggio delle IgE Anisakis simplex specifiche con metodo ImmunoCap. Nel campione di soggetti addetti alla lavorazione o vendita dei prodotti ittici, è stata riscontrata una positività allo SPT e una siero-prevalenza (IgE specifiche anti AS >0.35 KU/l) in 6 soggetti su 123 (pari al 4.9%). L’esito delle AS IgE è stato del 14.6% (14/96) nei soggetti che hanno dichiarato, nella loro attività lavorativa, contatto con pesce crudo, in salamoia e poco cotto nell’ultimo anno rispetto al 7.4% (2/27) nei soggetti non a contatto. In Tabella 2 si osservano nel suo insieme le informazioni raccolte dai questionari somministrati nei 123 soggetti testati; sono riportate le percentuali di positività, in riferimento agli esiti del dosaggio delle IgE specifiche con metodo ImmunoCap, per categoria professionale, per residenza, per uso di DPI e per sintomi allergici, risultati raccolti altresì nei grafici di seguito riportati.

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Caratteristiche

A.s. IgE >0,35 kU/l No (%) Yes (%) Total (%) 117 (88.3) 6 (4.9) 123 (100.0) Genere Maschio 94 (95.9) 4 (4.1) 98 (79.7) Femmina 23 (92) 2 (8.0) 25 (20.3) Tipo di impiego

Addetti alla vendita 15

(93.7)

1 (6.3)

16 (13) Dipendenti industria ittica 48

(96.0) 2 (4.0) 50 (40.7) Pescatori/marinai 29 (96.7) 1 (3.3) 30 (24.4) Cuochi/ addetti preparazione alimenti 25

(92.6) 2 (7.4) 27 (21.9) Tipo di residenza Città 55 (94.8) 3 (5.2) 58 (47.2) Entroterra 9 (100.0) 0 (0.0) 9 (7.3) Zone marine 53 (94.6) 3 (5.4) 56 (45.5) DPI Uso Regolare 26 (97.0) 1 (3.0) 27 (22) Uso Irregolare 45 (90) 5 (10) 50 (40.7) Nessun uso 39 (84.8) 7 (15.2) 46 (37.3) Contatto con pesce

crudo, in salamoia e poco cotto nell'ultimo anno Si 82 (85.4) 14 (14.6) 96 (78) No 25 (92.6) 2 (7.4) 27 (22) Sintomi allergici Si 46 (82.1) 10 (17.9) 56 (45.5) No 62 (92.5) 5 (7.5) 67 (54.5) Tabella 2. Caratteristiche sociodemografiche, informazioni professionali e sintomi allergici di 123 pazienti ambulatoriali con potenziale esposizione professionale alla AS e IgE specifiche anti-AS.

38 Riguardo il tipo di impiego, i risultati mostrano una positività del 7.4% (2/27) nella categoria dei cuochi/addetti alla preparazione degli alimenti, del 6.3% (1/16) negli addetti alla vendita, del 4% (2/50) nei dipendenti industria ittica e del 3.3% (1/30) nella categoria dei pescatori/marinai (Graf 1).

Riguardo la residenza, i risultati mostrano una positività del 5.4% (3/56) nei soggetti provenienti dalla zone marine costiere, del 5.2% (3/58) dalla città mentre i residenti in zone più lontane dalle coste, sono risultati negativi (Graf 2).

Nei soggetti che hanno dichiarato di non utilizzare i DPI, la positività è stata del 15.2% (7/46) rispetto all’uso irregolare o saltuario del 10% (5/50) e all’uso regolare del 3% (1/27) (Graf 3). Nei soggetti con sintomi allergici, la positività è risultata del 17.9% (10/56) mentre nei non allergici del 7.5% (5/67) (Graf 4).

Grafico1. Prevalenza IgE AS per categoria professionale

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Grafico 3. Prevalenza IgE AS per utilizzo DPI

Grafico 4. Prevalenza IgE AS per soggetti con sintomi allergici

Nei soggetti inclusi nello studio, afferenti agli ambulatori di allergologia, è stata riscontrata una positività allo SPT del 12% (74/613) mentre il dosaggio delle IgE specifiche con metodo ImmunoCap ha rilevato una positività dell’11% (68/613). Tra i soggetti risultati positivi, il 7% apparteneva ai pazienti con orticaria cronica, il 2% ha presentato una positività al dosaggio delle IgE per la tropomiosina, l’1% alle IgE per gli ascaridi e solo il restante 1% era rappresentato dai soggetti con clinica riferibile all’ipersensibilità ad Anisakis.

Nei soggetti positivi al dosaggio delle IgE specifiche anti-AS, testati successivamente con la western-blot (26 in totale), per ognuno sono stati utilizzati estratto crudo di A. simplex s. s. ed estratto crudo di A. pegreffii.

40 Tra i soggetti professionalmente esposti testati con la western-blot, un lavoratore (addetto alla lavorazione dei prodotti ittici) con segni clinici è risultato negativo sia al dosaggio delle IgE per Anisakis, tropomiosina ed Ascaris che al western-blot.

In due lavoratori che non presentavano manifestazioni cliniche riferibili ad una reazione allergica verso gli allergeni di Anisakis (senza sintomi allergici), la western-blot ha dato una maggiore risposta per gli estratti di A. pegreffii e una bassa risposta per quelli di A. simplex s. s.. La positività è stata confermata anche eseguendo le analisi con le due frazione proteiche (50-66%: contenente gli allergeni Ani s 1 e Ani s 4, 66-99% contenente gli allergeni appartenenti alla famiglia SxP Ral-2 Ani s 5, Ani s 8 e Ani s 9) (Fig 11).

Fig 11. Analisi immunoblot (WB) eseguita nel siero di un soggetto addetto alla lavorazione del pesce

Quindici soggetti hanno accettato di essere saggiati con il test di attivazione dei basofili (BAT) e sono stati pertanto richiamati per il prelievo di sangue. Per ognuno sono stati utilizzati: estratto crudo del commercio di Anisakis specificatamente realizzato per i dosaggi BAT (BṺHLMANN), estratto crudo di A. simplex s. s. ed estratto crudo di A. pegreffii testando diverse concentrazioni.

41 I risultati dei 15 soggetti testati con SPT, dosaggio IgE e BAT - dei quali n. 5 soggetti lavoratori- e il rimanente con clinica e/o dati di laboratorio suggestivi di ipersensibilità ad Anisakis (orticaria, angioedema, anafilassi), sono riportati in Tabella 3.

In particolare: un paziente con manifestazioni di orticaria-angioedema (pescatore), negativo sia al SPT che al dosaggio di IgE per Anisakis, per Tropiomiosina e Ascaris, è risultato positivo soltanto all’estratto BṺHLMANN.

Un soggetto (addetta alla lavorazione dei prodotti ittici) con segni clinici (orticaria- angioedema), positiva al SPT, è risultato negativo sia al dosaggio delle IgE per Anisakis, tropomiosina ed Ascaris che al BAT.

Gli altri 3 lavoratori testati, con anamnesi negativa (senza sintomi allergici), SPT e IgE Anisakis positivi, sono risultati positivi al test di attivazione dei basofili. Due di questi soggetti (un cuoco e un addetta alla vendita) hanno mostrato un’alta positività all’estratto BṺHLMANN e a quello di A. pegreffii (uno positivo anche a basse concentrazioni di allergene 0,9 ng/ml) e una bassa positività all’estratto crudo di A. simplex s. s. (positivi solo ad alta concentrazione di allergene 112,5ng/ml), mentre 1 (addetto alla vendita) è risultato positivo soltanto all’estratto commerciale BṺHLMANN (Tabella 4).

Tra i soggetti testati, non lavoratori del comparto ittico, che presentavano manifestazioni cliniche riferibili ad una reazione allergica verso gli allergeni di Anisakis, 4 sono stati confermati dal BAT. Due di questi pazienti mostravano un’alta percentuale di attivazione dei basofili per tutti e tre le tipologie di estratti utilizzati. Un soggetto, con orticaria- angioedema, è risultato positivo anche in presenza di basse concentrazioni di allergene (0,9 ng/ml), mentre il secondo soggetto ha avuto una risposta maggiore per gli estratti di A. pegreffii e una bassa risposta per quelli di A. simplex s. s. (positivo non oltre la concentrazione di 22,5 ng/ml). La positività è stata confermata anche eseguendo il BAT con le due frazione proteiche (50-66%: contenente gli allergeni Ani s 1 e Ani s 4, 66-99% contenente gli allergeni appartenenti alla famiglia SxP Ral-2 Ani s 5, Ani s 8 e Ani s 9). Un paziente (10 anni) con sintomi di diarrea e orticaria è risultato positivo al BAT solo ad alte concentrazioni 112,5 ng/ml di estratto di A. pegreffii e positivo al dosaggio di IgE per Anisakis e per tropomiosina. Per un paziente, con angioedema, è stato eseguito solamente il test con l’estratto commerciale BṺHLMANN al quale è risultato positivo. Gli altri 6 soggetti (3 con orticaria cronica e 1 con dermatite atopica, 1 con anafilassi idiopatica e 1 soggetto atopico), sono risultati negativi al BAT per tutti gli estratti proteici utilizzati e sono stati utilizzati come controllo.I risultati del BAT con gli estratti proteici di Anisakis a varie concentrazioni sono riportati in Tabella 4.

42 I nostri risultati mostrano come nella diagnosi di allergia verso Anisakis può essere utile l’applicazione di una serie di test a cascata, che non si limiti pertanto soltanto all’applicazione dei test diagnostici di routine: a tal proposito Brusca et al, 2019 propongono l’applicazione di un algoritmo diagnostico (Fig 12).

Figura 12. Algoritmo diagnostico per allergia ad Anisakis (da Brusca et al., 2019)

È stata riscontrata una differenza significativa tra la risposta al BAT dei soggetti positivi (IgE per Anisakis con clinica) e dei soggetti negativi (negativi e controlli) (p=0,0009). C’è stata inoltre una differenza significativa tra l’attivazione dei basofili ottenuta con gli estratti di A. pegreffii e quelli di A. simplex s. s. (p=0,005) valutati alla concentrazione di 0,9 ng/ml, in cui è stata riscontrata una risposta maggiore verso gli allergeni di A. pegreffii.

43

Tabella 3. Dati n. 15 soggetti testati con SPT, IgE Anisakis, Ascaris e Tropomiosina e BAT

N Anamnesi Età Sesso SPT _Anisakis IgE* kU/L IgE* Tropiomosina kU/L IgE* Ascaris kU/L Anisakis/ Ascaris IgE Ratio BAT 1 _angioedema Orticaria/ (pescatore) 68 M - 0 0 0 - P 2 Orticaria angioedema (addetto industria pesce) 41 F + 0,01 0,01 0,01 - N

3 Nessun sintomo _(cuoco) 45 M + >100 0,01 0,3 >100 P

4 Nessun sintomo (addetto alla vendita) 27 M + 1,09 0,02 0 - P 5 Nessun sintomo (addetto industria pesce) 43 F + 7,9 0 0 - P 6 Anafilassi 52 F + 6,87 0.01 0 P 7 _angioedema Orticaria 69 F + 98,2 0 8,96 10,95 P 8 Angioedema 23 F + 6,75 0,02 0,08 84,37 P 9 Diarrea e _orticaria 10 M + 0,6 3,14 1,32 0,45 P 10 Dermatite atopica 55 F + 0,8 0,1 8 N 11 Orticaria _cronica 74 F + 0,76 0 0,04 19 N 12 Orticaria _cronica 64 F + 54,5 0 5,47 9,96 N 13 Soggetto _atopico 30 F + 0,12 0,10 0,13 1 N 14 Anafilassi _idiopatica 46 F + 0,03 0 0 0 N 15 Orticaria _cronica 33 F + 0,29 0 0,55 0,52 N

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Tabella 4. Risultati test di attivazione dei basofili (BAT).

B= estratto BṺHLMANN; A.p= estratto di Anisakis pegreffii; A.s= estratto di Anisakis simplex sensu stricto. N Anamnesi _{BAT (%)*} B 22,5 ng/ml A.p 112,5 ng/ml A.p 22,5 ng/ml A.p 4,5 ng/ml A.p 0,9 ng/ml A.s 112,5 ng/ml A.s 22,5 ng/ml A.s 4,5 ng/ml A.s 0,9 ng/ml 1 angioedema Orticaria/ (pescatore) 39,5 0,8 0,6 0,4 0 2,2 1,3 0.5 5,7 2 Orticaria angioedema (addetto industria pesce) 1,2 0,74 0,81 0 0 0 0,39 0 0

3 Nessun sintomo _(cuoco) 55,2 84,1 75,1 61 16,2 44,5 10 1,1 0,7

4 Nessun sintomo (addetto alla vendita) 59,1 3,39 0,81 0 0 0 0 0 0 5 Nessun sintomo (addetto industria pesce) 48,8 26,7 54,3 33,7 12,2 36,1 7 0,67 1,21 6 Anafilassi 70,1 83,6 75,4 58,6 20,8 43,6 28 3,5 0 7 _angioedema Orticaria 84,4 75,5 79,9 75,1 53,3 84,5 80 72,3 32,4 8 Angioedema 15,2 - - - - 9 Diarrea e _orticaria 0,8 43,8 9 1,2 0,6 0,5 0,9 0,5 0 10 Dermatite _atopica 0,8 1,7 0,2 0 0 0,3 1,8 0,2 0 11 Orticaria _cronica 0,8 0 0,6 0 0,6 0,6 0 0 0,9 12 Orticaria _cronica 2,3 0 0 0 0 0 0 0 0 13 Soggetto _atopico 4,3 0 0 0 0 0 0 0 0 14 Anafilassi _idiopatica 4,7 2,8 0 0 0 8,8 3,9 0 0 15 Orticaria _cronica 0 0 1,93 0 0 0,91 1,09 0 0

45 5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

Il nematode Anisakis è stato descritto come un rilevante fattore eziologico nell’insorgenza dell’orticaria acuta e di episodi di anafilassi (Audicana et al., 1995; Del Pozo et al., 1997).

La mancanza di un gold standard comporta una diagnosi basata sulla storia clinica del paziente, ingestione di pesce fresco nelle ore precedenti la manifestazione dei sintomi, positività allo SPT e alla presenza di IgE specifiche all'estratto di Anisakis ed esclusione di altre possibili cause di allergia (Sastre et al., 2000).

Nella pratica clinica, la diagnosi di allergia ad Anisakis può essere però difficoltosa: individui sani possono avere alti livelli nel siero di IgE verso allergeni di Anisakis in assenza di sintomatologia clinica, mentre altri soggetti hanno bassi livelli di IgE specifiche pur mostrando rilevanti manifestazioni cliniche. Alcuni studi indicano che il 16% -22% dei donatori di sangue hanno IgE specifiche per Anisakis (Del Rey Moreno et al., 2006; Del Pozo et al., 1996). Circa il 24% dei pazienti con orticaria acuta presenta uno SPT positivo e/o IgE specifiche verso gli allergeni di Anisakis, anche se soltanto nel 33% di questi casi, Anisakis risulta essere la reale causa scatenante (Del Pozo et al., 1997). Di conseguenza l’allergia ad Anisakis è spesso diagnosticata in modo scorretto. Nella valutazione clinica di questa patologia sono da tenere in considerazione, come già detto in precedenza, gli eventi di cross-reattività, ai quali è da attribuire la presenza di un'elevata percentuale di individui sani con SPT e/o IgE specifiche verso gli allergeni di Anisakis (Reese et al., 1999; Asturias et al., 1999; Johansson et al., 2001).

Un valore da prendere in considerazione per valutare questi casi è il rapporto di IgE Anisakis/Ascaris, studi precedenti hanno infatti mostrato che un valore di ratio ≥4,4 può incrementare la specificità al 95% per i soggetti aventi le IgE verso Ascaris ≥0,35 (Carballeda et al., 2014).

Diversi studi hanno rilevato un’associazione significativa tra l’orticaria cronica e la sensibilizzazione ad Anisakis (Frezzolini et al., 2010; Ventura et al., 2013). Dal momento che le reazioni allergiche non costituiscono causa di orticaria cronica, è stato ipotizzato che l’ipersensibilità ad Anisakis potrebbe avere un effetto di concausa in un subset di pazienti con orticaria cronica nei quali sono stati rilevati significativi miglioramenti clinici dopo una dieta priva di pesce, valutati anche dalla riduzione dei parametri immunologici (ridotti valori delle IgE specifiche e dei basofili attivati) (Frezzolini et al., 2010). Per tutte queste motivazioni la diagnosi di laboratorio dell'allergia di Anisakis

46 richiede lo sviluppo di test sierologici sensibili e specifici che possano superare questi problemi.

Numerosi lavori sono riportati in bibliografia sull’argomento “Anisakis e allergia” con alte prevalenze nella positività riscontrata sia in diverse categorie di soggetti sia, in realtà, con modalità di indagini diagnostiche limitate, ad es. solo l’utilizzo dello SPT. Con questa metodica viene riportata, in soggetti afferenti all’ambulatorio di allergologia nella zona della Sicilia orientale, una prevalenza del 15,4% (Heffler et al., 2016). Uno studio svolto su 34 centri italiani di allergologia nel 2010, ha riportato una positività del 4.5% in soggetti ambulatoriali con sospetta allergia ad Anisakis. In Puglia in pazienti con orticaria cronica viene riportata, con SPT, una prevalenza del 49.7% (Ventura et al., 2013).

Nella nostra indagine la positività allo SPT nei soggetti afferenti al laboratorio di allergologia è stata del 12% mentre il dosaggio delle IgE specifiche con metodo ImmunoCap è risultata dell’11%: tale prevalenza, a sua volta, non è da considerarsi sempre significativa, in quanto un’alta percentuale dei positivi al dosaggio delle IgE (il 7%) apparteneva a soggetti con orticaria cronica e un 3% era dovuto a cross-reattività (soggetti positivi alla tropomiosina da altra fonte allergenica o agli allergeni di Ascaris), pertanto solo il restante 1% era rappresentato dai soggetti con clinica riferibile alla sensibilizzazione ad Anisakis.

In Italia la prevalenza di sensibilizzazione ad Anisakis sembra essere più alta nelle zone costiere e nelle grandi città (AAITO-IFACI Anisakis Consortium 2011) a causa probabilmente delle tradizioni culinarie e delle abitudini alimentari importate. In Sicilia in particolare la tradizione gastronomica prevede preparazioni a base di pesce crudo o marinato (alici marinate o sarde sotto sale) che potrebbero essere la prima causa di sensibilizzazione ad Anisakis. Inoltre un’altra causa rilevante potrebbe essere legata all’attività professionale come nel caso dei pescatori o gli addetti alla lavorazione ed alla vendita del pesce.

Nel nostro studio sono stati valutati in particolare i soggetti lavoratori potenzialmente a rischio di contatto con gli allergeni di Anisakis, tra i quali è risultata una prevalenza di positività di IgE Anisakis specifiche del 4.9%: tale positività è stata confermata nella maggior parte dei soggetti con il metodo western-blotting (4 su 5 testati ed un positivo che ha rifiutato i successivi approfondimenti diagnostici). Questi dati confermano una prevalenza di sensibilizzazione più alta tra i soggetti lavoratori rispetto ai pazienti afferenti ai laboratori di allergologia. I dati ottenuti mostrano che i lavoratori più esposti sarebbero gli addetti alla preparazione (cuochi) degli alimenti (7.4%) seguiti dagli addetti

47 alla vendita (6.3%) probabilmente per il maggior contatto e per il non utilizzo di DPI. In generale, il contatto con pesce crudo o poco cotto ha dato un esito decisamente maggiore (14.6%) rispetto ai soggetti che dichiarano un mancato contatto (7.4%), così come il non utilizzo dei DPI (15.2%) rispetto all’uso regolare (3.0%).

La prevalenza è risultata maggiore nei soggetti maschi rispetto ai soggetti femminili ma ciò è dovuto al maggior reclutamento dei primi (79.7%) rispetto ai secondi (20.3%) nelle varie categorie professionali. Maggiore inoltre la prevalenza dei soggetti provenienti dalle zone costiere marine (5.4%) e dalle città (5.2%) rispetto alle zone interne.

Uno studio in una popolazione di soggetti professionalmente esposti in Sicilia ha rilevato una positività del 19.8% per IgE totali e dell’11.7% per IgE specifiche per Anisakis (Mazzucco et al., 2012), con metodo UniCap-100, percentuale più alta rispetto a quanto da noi riscontrato. Questa differenza è da ascrivere principalmente ai soggetti reclutati: nello studio di Mazzucco et al., 2012, la maggior parte dei soggetti studiati erano pescatori e marinai seguiti da dipendenti industrie ittiche. Nella nostra casistica la maggior parte (50/123) lavoravano nell’ industria di trasformazione di prodotti ittici, in cui, verosimilmente, vigono misure di prevenzione più accurate.

Sempre in Sicilia, Purello-D’Ambrosio et al., 2000, indica la categoria dei pescatori e addetti alla vendita dei prodotti ittici, come più a rischio per la sensibilizzazione ad Anisakis simplex riportando una positività del 50% di IgE specifiche per Anisakis con metodo Radio Allergo Sorbent test (RAST).

In un recente studio epidemiologico retrospettivo sull’anisakiasi umana, viene stimata un’incidenza globale dello 0.32/100,000 soggetti esaminati con manifestazioni cliniche non solo limitate a forme gastrointestinali ma spesso associate a reazioni allergiche (Guardone et al., 2018). In Italia, la maggior parte dei casi di anisakidosi umana è causata da A. pegreffii con lo stadio di larve L3 del parassita trovato principalmente nelle alici marinate, specie ittica più rilevante per la pesca italiana (Guardone et al., 2018). In Sicilia si trovano diverse Industrie Ittico Conserviere (prov di Palermo e di Agrigento) addette alla lavorazione e trasformazione delle alici sotto forma di alici sott’olio, sotto sale, marinate.

Mazzucco et al., 2018 in una recente review sui casi di sensibilizzazione ad Anisakis a livello mondiale, riporta la presenza di IgE specifiche per Anisakis, determinate con ELISA o ImmunoCap, dallo 0.4 al 27.4% in soggetti asintomatici e tra 0.0% (in bambini) e l’81.3% (in adulti allergici ai prodotti ittici).

48 Il presente studio ha mostrato che l’utilizzo della western-blot per la sieroprevalenza di IgE Anisakis- correlati è un valido approccio per la diagnosi di allergia nei confronti di questo nematode. Il presente metodo discrimina tra i pazienti positivi ad Anisakis e controlli sani con una elevatissima sensibilità ed specificità. Dai nostri dati preliminari sull’utilizzo della metodica di western-blot è risultato che i soggetti con orticaria cronica spontanea non correlata all’ingestione di pesce e gli altri soggetti utilizzati come controlli (1 con dermatite atopica, 1 con anafilassi idiopatica ed 1 soggetto atopico) sono stati confermati negativi.

Dei 6 soggetti reclutati nell’ambulatorio di allergologia, risultati positivi alle IgE Anisakis specifiche (>0.35 KU/l), 5 sono stati confermati con la western-blot, utilizzando antigeni escretori/secretori (ES) ed estratto crudo di A. pegreffii e di A. simplex s.s., evidenziando in particolare, la reattività all’estratto crudo di A. pegreffii rispetto ad A. simplex s.s., come riportato in precedenza.

In uno studio su soggetti italiani con anisakiasi gastro-allergica o orticaria cronica dopo consumo di pesce, paragonando il metodo ImmonoCap (iCAP) con Immunoblotting (WB) usando antigeni escretori/secretori (ES) ed estratto crudo di A. pegreffii, ha rilevato nel 25.4%, IgE positività con entrambi i metodi. In 5 casi in particolare iCAP è stato >100 kU/L e and IgE-WB positivo a antigeni ES di A. pegreffii (Ani s 1, Ani s 7, Ani s 13) (Mattiucci et al., 2017)

Riguardo la metodica BAT, studi precedenti (Gonzalez-Munoz et al., 2005; Frezzolini et al., 2010) hanno mostrato che l’utilizzo della citofluorimetria per valutare l’espressione di CD63 nei basofili attivati dagli allergeni di Anisakis, risulta un valido approccio per la diagnosi di allergia nei confronti di questo nematode.

In particolare Frezzolini et al., 2010, hanno confrontato la BAT con SPT e ImmunoCAP nella diagnosi della sensibilizzazione all' Anisakis nei pazienti con orticaria cronica, soggetti atopici e controlli sani: i risultati del lavoro hanno mostrato una buona sensibilità, simile per tutti e tre i test ma la massima specificità del 100% è stata raggiunta solo dalla BAT a supporto della BAT come strumento diagnostico affidabile per l'anisakiasi, con conseguente prevalenza della sensibilizzazione del 67% tra i pazienti con orticaria cronica e 0% tra i soggetti sani.

I soggetti esaminati nel nostro studio, con orticaria conica spontanea non correlata all’ingestione di pesce e gli altri soggetti utilizzati come controlli (1 con dermatite atopica, 1 con anafilassi idiopatica ed 1 soggetto atopico) sono stati confermati negativi dal BAT. Tra i soggetti positivi all’analisi BAT, cinque presentavano manifestazioni

49 cliniche seguite all’ingestione di pesce o cefalopodi (orticaria-angioedema e anafilassi di 3°grado) e gli altri 3 (addetti alla lavorazione o alla vendita di prodotti ittici) presentavano un’anamnesi negativa per reazioni allergiche ad Anisakis: questi soggetti hanno dichiarato di non consumare abitualmente prodotti ittici. In un soggetto la positività, rilevata soltanto ad alte concentrazioni di allergene (112,5 ng/ml), era dovuta ad una sensibilizzazione verso la tropomiosina.

Nei soggetti positivi è stata determinata una risposta maggiore verso gli allergeni di A. pegreffii rispetto a quelli di A. simplex s. s., ciò è da attribuire al consumo maggiore di prodotti ittici del Mediterraneo dove A. pegreffii è la specie predominante, confermando il ruolo del pesce locale rispetto a quello importato.

Ad oggi non esistono linee guida chiare per quanto riguarda le restrizioni dietetiche per i pazienti con ipersensibilità ad Anisakis, anche se alcuni autori hanno riportato un