Analisi statistica

I risultati sono stati analizzati tramite i software per l’analisi di dati di Real-Time qBase (Biogazelle) e Data Assist (AB analytics). Le analisi statistiche sono state effettuate tramite il sotware GraphPad Prism.

3.3 RISULTATI

3.3.1 Confronto tra i risultati su campioni FFPE e quelli su campioni non fissati Abbiamo confrontato i profili d’espressione dei miRNA ottenuti dai tessuti non fissati con quelli ottenuti dai campioni FFPE. In tal modo abbiamo voluto verificare l’importanza della rappresentatività del tessuto esaminato nell’analisi dei miRNA. In effetti, nonostante venga effettuata una sezione congelata per valutare la composizione del tessuto in esame, quando si estrae da tessuto non fissato è più difficile determinare la percentuale di cellule neoplastiche rispetto al background di cellule non tumorali. La presenza di questi

“contaminanti” può portare a dei risultati che risentono dell’effetto del profilo di espressione dei miRNA presenti nelle cellule non neoplastiche.

Ne è prova il fatto che paragonando i livelli di espressione dei miRNA tra le due metodiche, i dati ottenuti non appaiono sovrapponibili (figure 2 e 3).

Figura 2. Istogramma raffigurante il fold change dell’espressione di ogni singolo miRNA nei

campioni FFPE e negli stessi campioni non fissati. Si può notare come vi siano notevoli differenze nei profili d’espressione, nonostante i pazienti in esame siano gli stessi.

Figura 3. Heat-map (Pearson’s correlation) dei singoli campioni FFPE (contrassegnati da una sigla con acronimo FFPE) e non fissati. I tessuti provenienti dagli stessi pazienti sono indicati con identici colori. E’ possibile osservare come gli stessi campioni clusterizzino differentemente in base al profilo d’espressione dei miRNA, a seconda che siano fissati o meno.

Tali discrepanze possono essere legate alla presenza di cellule “non neoplastiche” nel campione non fissato: si ottiene dunque un risultato non corrispondente al profilo del tumore stesso, ma altresì mescolato con il profilo d’espressione delle cellule non tumorali presenti nel campione, ad esempio i linfociti.

Alla luce di tali considerazioni per la determinazione del profilo di espressione dei miRNA nei GL ed il confronto dei risultati ottenuti con quelli di campioni non neoplastici, sono stati presi in considerazione i profili ottenuti da campioni FFPE. I risultati finora valutati si riferiscono a 15 GL e 5 casi non neoplastici.

3.3.2 miRNA nei glioblastomi

Nel confronto del profilo dei miRNA ottenuto dai GL con quello osservato in campioni non neoplastici abbiamo rilevato che alcuni miR sono sovraespressi (ad esempio miR10b, miR21 e miR27a) mentre altri downregolati (miR7, miR137) (vedi Tabella 3 e Figura 4).

Tabella 3. Fold-change dell’espressione di ogni miRNA nei GL rispetto al tessuto non neoplastico.

miR Fold Change

miR101 11,37 miR10a 25,31 miR10b 83,24 miR137 -6,12 miR17 11,67 miR182 20,32 miR20a 5,48 miR21 63,43 miR221 1,50 miR222 -1,07 miR26a 2,77 miR27a 24,22 miR31 1,56 miR330 2,34 miR34a 9,75 miR519d 1,83 miR7 -5,41 miR9 11,92 miR9* 13,06

Figura 4. Istogramma mostrante il Fold-change dell’espressione di ogni miRNA nei GL rispetto al tessuto non neoplastico

La clusterizzazione dei campioni mostra come i GL si raggruppino indipendentemente dai campioni normali (Figura 5).

Figura 5. In questa Heat-map (Pearson’s correlation) si può notare come i campioni di GL (contrassegnati da una sigla ROSSA) clusterizzino indipendentemente rispetto ai campioni non neoplastici (contrassegnati da una sigla BLU), in base al profilo di espressione dei miRNA.

3.4 DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

I risultati preliminari del presente studio hanno messo in evidenza 6 miRNA con differenze di espressione maggiormente significative tra GL e tessuto normale: 4 sono risultati iperespressi (miR10b, miR21, miR182, miR27a) e 2 ipoespressi (miR137, miR7). Il miR10b è già stato osservato iperespresso nei GL [22, 80]. Il suo gene è localizzato sul cromosoma 2q31, vicino HOXD4, ed è altamente espresso nelle cellule dei carcinomi mammari metastatici, favorendo la migrazione e l’invasività cellulare [81]. Inoltre

miR10b inibisce la traduzione di HOXD10, con conseguente aumento dell’espressione di RhoC, un noto gene che promuove l’attività metastatica [80].

Il miR21 è già stato osservato iperespresso nei GL [15]. Esso appare agire nelle cellule di questi tumori come un importante oncogene che ha come target un network costituito da p53, TGF-B e geni oncosoppressori di apoptosi mitocondriale [82]. In pratica miR-21 nei GL è necessario per la soppressione dell’apoptosi [82].

Anche il miR182 è già stato osservato iperespresso nei GL ed è stata trovata una correlazione tra l’espressione di questo miR e la prognosi dei pazienti [83].

Il miR27a ha una funzione oncogenica già nota nel carcinoma gastrico [84] e in quello colico [85], ma non ci risulta ancora descritto un suo ruolo definito nell’oncogenesi dei GL.

Per quanto riguarda miR137, i livelli di questo miRNA sono risultati significativamente ridotti nei GL rispetto al tessuto normale. Questo dato è già stato osservato [23] e correla con il fatto che il miR137 è un diretto inibitore di CDK6 ed ha potenti effetti

antiproliferativi e pro-differentiativi, promuovendo l’arresto del ciclo cellulare. Infine per quanto riguarda il miR7, anche l’espressione di questo miRNA è risultata significativamente ridotta nei GL rispetto al tessuto normale. E’ già stato riportato che il

miR7 agisce con una funzione di oncosoppressore, contrastando l’espressione di EGFR e pathway di Akt [86].

I risultati osservati sono complessivamente in accordo con quelli trovati per i singoli miR nei lavori riportati in letteratura, sebbene i fold-change talora non appaiono sovrapponibili. Tali difformità possono trovare una spiegazione nelle seguenti osservazioni: il presente studio è ancora in fase di svolgimento, pertanto la coorte è ristretta; in questo studio sono stati utilizzati primers LNA, che conferiscono maggiore specificità alla reazione; infine, a differenza di molti dei lavori apparsi fino ad oggi effettuati su culture cellulari, in questo caso sono stati analizzati i tessuti FFPE di GL operati.

In conclusione, nonostante i risultati ottenuti siano ancora preliminari, emergono le seguenti considerazioni:

1) L’analisi di espressione dei miRNA può essere effettuata su tessuto in paraffina, a differenza degli studi basati su RNAm, ottenendo risultati più specifici e attendibili in virtù di una più accurata selezione del tessuto neoplastico. Inoltre questa possibilità consente di studiare i miRNA sui tessuti conservati negli Archivi di Anatomia Patologica e di effettuare studi retrospettivi.

2) Si delinea un profilo genico basato sui 6 miRNA con differenze di espressione (iper o ipoespressi) maggiormente significative tra GL e tessuto normale: tale profilo può avere implicazioni prognostiche e potrebbe costituire la base su cui sviluppare una possibile target-therapy.

BIBLIOGRAFIA.

1. Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 2005; 352: 987-996. 2. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD et al. World Health Organization classification

of tumours of the central nervous system. IARC Press, Lyon, 2007.

3. Coons SW, Johnson PC, Scheithauer BW et al. Improving diagnostic accuracy and interobserver concordance in the classification and grading of primary gliomas. Cancer 1997; 79: 1381–1393.

4. Aldape K, Simmons ML, Davis RL et al. Discrepancies in diagnoses of neuroepithelial neoplasms: the San Francisco Bay Area Adult Glioma Study. Cancer. 2000; 88: 2342-2349.

5. Bruner JM, Inouye L, Fuller GN et al. Diagnostic discrepancies and their clinical impact in a neuropathology referral practice. Cancer 1997; 79: 796-803.

6. Nakagawa Y, Perentes E, Rubinstein L. Immunohistochemical characterization of oligodendrogliomas: an analysis of multiple markers. Acta Neuropathol 1986; 72: 15–22.

7. Preusser M, Lehotzky A, Budka H et al. TPPP/p25 in brain tumours: expression in non-neoplastic oligodendrocytes but not in oligodendroglioma cells. Acta

Neuropathol 2007; 113: 213–215.

8. Preusser M, Laggner U, Haberler C et al. Comparative analysis of NeuN immunoreactivity in primary brain tumours: conclusions for rationale use in diagnostic histopathology. Histopathology 2006; 48: 438-444.

9. Giangaspero F, Cenacchi G, Losi L et al. Extraventricular neoplasms with

neurocytoma features. A clinicopathological study of 11 cases. Am J Surg Pathol 1997; 21: 206-212.

10. Wharton SB, Chan KK, Hamilton FA et al. Expression of neuronal markers in oligodendrogliomas: an immunohistochemical study. Neuropathol Appl Neurobiol 1998; 24: 302-308.

11. Vyberg M, Ulhøi BP, Teglbjaerg PS. Neuronal features of oligodendrogliomas-- an ultrastructural and immunohistochemical study. Histopathology 2007; 50: 887- 896.

12. Marie Y, Sanson M, Mokhtari K. OLIG2 as a specific marker of oligodendroglial tumour cells. Lancet 2001; 358: 298–300.

13. Kuhlmann T, Gutenberg A, Schulten H-J et al. Nogo-A Expression in Glial CNS Tumors. A Tool to Differentiate Between Oligodendrogliomas and Other

Gliomas? Am J Surg Pathol 2008; 32: 1444–1453.

14. Fallon KB, Palmer CA, Roth KA et al. Prognostic value of 1p, 19q, 9p, 10q, and EGFR-FISH analyses in recurrent oligodendrogliomas. J Neuropathol Exp Neurol 2004; 63: 314-322.

15. Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res 2005; 65: 6029–6033.

16. Shi L, Chen J, Yang J et al. MiR-21 protected human glioblastoma U87MG cells from chemotherapeutic drug temozolomide induced apoptosis by decreasing

17. Kima H, Huangb W, Jiangb X et al. Integrative genome analysis reveals an

oncomir/oncogene cluster regulating glioblastoma survivorship. PNAS 2010; 107: 2183–2188.

18. Lee ST, Chu K, Oh HJ et al. Let-7 microRNA inhibits the proliferation of human glioblastoma cells. J Neurooncol. 2010 Jul 7. [Epub ahead of print]

19. Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. MicroRNA-21 Is an Antiapoptotic Factor in Human Glioblastoma Cells. Cancer Res 2005; 65: 6029-6033.

20. Gillies JK, Lorimer IAJ. Regulation of p27Kip1 by miRNA 221/222 in Glioblastoma. Cell Cycle 2007; 6: 2005-2009.

21. Godlewski J, Nowicki MO, Bronisz A et al. Targeting of the Bmi-1

oncogene/stem cell renewal factor by microRNA-128 inhibits glioma proliferation and self-renewal. Cancer Res 2008; 68: 9125–9130.

22. Ciafre` SA, Galardi S, Mangiola A et al. Extensive modulation of a set of

microRNAs in primary glioblastoma. Biochem Biophys Res Commun 2005; 334: 1351–1358.

23. Silber J, Lim DA, Petritsch C et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Med 2008; 6: 14.

24. Nutt CL, Mani DR, Betensky RA et al. Gene expression based classification of malignant gliomas correlates better with survival than histological classification. Cancer Res 2003; 63: 1602–1607.

25. Reifenberger G, Louis DN. Oligodendroglioma: toward molecular definitions in diagnostic neuro-oncology. J Neuropathol Exp Neurol 2003; 62: 111–126.

26. Gajjar A, Hernan R, Kocak M et al. Clinical, histopathologic and molecular markers of prognosis: toward a new disease risk stratification system for medulloblastoma. J Clin Oncol 2004; 22: 984–993.

27. van ‘t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415: 530–536.

28. Zahrak M, Parmigiani G, Wayne Y. Pre-processing Agilent microarray data. BMC Bioinformatics 2007; 8: 142.

29. Smyth GK, Speed TP. Normalization of cDNA microarry data. Methods 2003; 31: 265–273.

30. Tibshirani R, Hastie T, Narasimhan B et al. Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 6567– 6572.

31. Smyth GK. Linear models and empirical Bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol 2004; 3: 1–10. 32. Pattyn F, Speleman F, De PaepeA et al. RTPrimerDB: the realtime PCR primer

and probe database. Nucleic Acids Res 2003; 31: 122–123.

33. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 2002; 18: 3–4.

34. Flyvbjerg A, Mogensen O, Mogensen B et al. Elevated serum insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP-2) and decreased IGFBP-3 in epithelial ovarian cancer: correlation with cancer antigen 125 and tumor-associated trypsin inhibitor.

35. el Atiq F, Garrouste F, Remacle-Bonnet M et al. Alterations in serum levels of insulin-like growth factors and insulin-like growth-factor-binding proteins in patients with colorectal cancer. Int J Cancer 1994; 57: 491-497.

36. Ho PJ, Baxter RC. Insulin-like growth factor-binding protein-2 in patients with prostate carcinoma and benign prostatic hyperplasia. Clin Endocrinol 1997; 46: 333-342.

37. Richardsen E, Ukkonen T, Bjørnsen T et al. Overexpression of IGBFB2 is a marker for malignant transformation in prostate epithelium. Virchows Arch 2003; 442: 329-335.

38. Ranke MB, Maier KP, Schweizer R et al. Pilot study of elevated levels of insulin- like growth factor-binding protein-2 as indicators of hepatocellular carcinoma. Horm Res 2003; 60: 174-180.

39. Russo VC, Schütt BS, Andaloro E et al. Insulin-like growth factor binding

protein-2 binding to extracellular matrix plays a critical role in neuroblastoma cell proliferation, migration, and invasion. Endocrinology 2005; 146: 4445-4455. 40. Dunlap SM, Celestino J, Wang H et al. Insulin-like growth factor binding protein

2 promotes glioma development and progression. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104: 11736-11741.

41. Wang H, Wang H, Shen W et al. Insulin-like growth factor binding protein 2 enhances glioblastoma invasion by activating invasion-enhancing genes. Cancer Res 2003; 63: 4315-4321.

42. Godard S, Getz G, Delorenzi M et al. Classification of human astrocytic gliomas on the basis of gene expression: a correlated group of genes with angiogenic activity emerges as a strong predictor of subtypes. Cancer Res 2003; 63: 6613- 6625.

43. Fang G, Yu H, Kirschner MW. Direct binding of CDC20 protein family members activates the anaphase-promoting complex in mitosis and G1. Mol Cell 1998; 2: 163-171.

44. Ouellet V, Guyot MC, Le Page C et al. Tissue array analysis of expression microarray candidates identifies markers associated with tumor grade and outcome in serous epithelial ovarian cancer. Int J Cancer 2006; 119: 599-607. 45. Kim JM, Sohn HY, Yoon SY et al. Identification of gastric cancer-related genes

using a cDNA microarray containing novel expressed sequence tags expressed in gastric cancer cells. Clin Cancer Res 2005; 11: 473-482.

46. Mondal G, Sengupta S, Panda CK et al. Overexpression of CDC20 leads to impairment of the spindle assembly checkpoint and aneuploidization in oral cancer. Carcinogenesis 2007; 28: 81-92.

47. Yuan B, Xu Y, Woo JH et al. Increased expression of mitotic checkpoint genes in breast cancer cells with chromosomal instability. Clin Cancer Res 2006; 12: 405- 410.

48. Kidokoro T, Tanikawa C, Furukawa Y et al. CDC20, a potential cancer

therapeutic target, is negatively regulated by p53. Oncogene 2008; 27: 1562-1571. 49. Zhang L, Huang W, Chen J et al. Expression of IGFBP2 in gastric carcinoma and

relationship with clinicopathologic parameters and cell proliferation. Dig Dis Sci 2007; 52: 248-253.

50. Elmlinger MW, Deininger MH, Schuett BS et al. In vivo expression of insulin- like growth factor-binding protein-2 in human gliomas increases with the tumor

51. Yokota T, Kouno J, Adachi K et al. Identification of histological markers for malignant glioma by genome-wide expression analysis: dynein, alpha-PIX and sorcin. Acta Neuropathol 2006; 111: 29-38.

52. Boda B, Mas C, Muller D. Activity-dependent regulation of genes implicated in X-linked non-specific mental retardation. Neuroscience 2002; 114: 13-17. 53. Kuhlmann T, Gutenberg A, Schulten H-J et al. Nogo-A Expression in Glial CNS

Tumors. A Tool to Differentiate Between Oligodendrogliomas and Other Gliomas? Am J Surg Pathol 2008; 32: 1444–1453.

54. Buss A, Sellhaus B, Wolmsley A et al. Expression pattern of Nogo-A protein in the human nervous system. Acta Neuropathol 2005; 110: 113–119.

55. Wang X, Chun S-J, Treloar H et al. Localization of Nogo-A and Nogo-66 receptor proteins at sites of axon-myelin and synaptic contact. J Neurosci 2002; 22: 5505– 5515.

56. Jung TY, Jung S, Lee KH et al. Nogo-A expression in oligodendroglial tumors. Neuropathology. 2011; 31: 11-19.

57. Jenkins RB, Blair H, Ballman KV et al. A t(1;19)(q10;p10) mediates the

combined deletions of 1p and 19q and predicts a better prognosis of patients with oligodendroglioma. Cancer Res 2006; 66: 9852–9861.

58. Griffin CA, Burger P, Morsberger L et al. Identification of del(1;19)(q10;p10) in five oligodendrogliomas suggests mechanism of concurrent 1p and 19q loss. J Neuropathol Exp Neurol 2006; 65: 988–994.

59. Ducray F, El Hallani S, Idbaih A. Diagnostic and prognostic markers in gliomas. Current Opinion in Oncology 2009; 21: 537–542.

60. Smith JS, Perry A, Borell TJ et al. Alterations of chromosome arms 1p and 19q as predictors of survival in oligodendrogliomas, astrocytomas, and mixed

oligoastrocytomas. J Clin Oncol 2000; 18: 636-645.

61. Ligon KL, Alberta JA, Kho AT et al. The oligodendroglial lineage marker OLIG2 is universally expressed in diffuse gliomas. J Neuropathol Exp Neurol 2004; 63: 499-509.

62. Aldape K, Burger PC, Perry A. Clinicopathologic aspects of 1p/19q loss and the diagnosis of oligodendroglioma.Arch Pathol Lab Med 2007; 131: 242-251. 63. Ino Y, Betensky RA, Zlatescu MC et al. Molecular subtypes of anaplastic

oligodendroglioma: implications for patient management at diagnosis. Clin Cancer Res 2001; 7: 839-845.

64. Preusser M, Charles Janzer R, Felsberg J et al. Anti-O6-methylguanine-

methyltransferase (MGMT) immunohistochemistry in glioblastoma multiforme: observer variability and lack of association with patient survival impede its use as clinical biomarker. Brain Pathol 2008; 18: 520-532.

65. Karayan-Tapon L, Quillien V, Guilhot J et al. Prognostic value of O6-

methylguanine-DNA methyltransferase status in glioblastoma patients, assessed by five different methods. J Neurooncol 2010; 97: 311-322.

66. Agueli C, Cammarata G, Salemi D et al. 14q32/miRNA clusters loss of

heterozygosity in acute lymphoblastic leukemia is associated with up-regulation of BCL11a. Am J Hematol 2010; 85: 575-578.

68. John B, Enright AJ, Aravin A et al. Human microRNA targets. PLoS Biol 2004; 2: e363.

69. Lewis BP, Shih IH, Jones-Rhoades MW et al. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell 2003; 115: 787–798.

70. Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic

leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99: 15524-15529.

71. Bandres E, Cubedo E, Agirre X et al. Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues. Mol Cancer 2006; 5: 29.

72. Iorio MV, Ferracin M, Liu CG et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res. 2005; 65: 7065–7070.

73. Yanaihara N, Caplen N, Bowman E et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis. Cancer Cell 2006; 9: 189–198.

74. Murakami Y, Yasuda T, Saigo K et al. Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues. Oncogene 2006; 25: 2537–2545.

75. Eis PS, Tam W, Sun L et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 3627–3632.

76. Laganà A, Russo F, Sismeiro C et al. Variability in the incidence of miRNAs and genes in fragile sites and the role of repeats and CpG islands in the distribution of genetic material. PLoS One 2010; 5: e11166.

77. Wang X, Tang S, Le SY et al. Aberrant expression of oncogenic and tumor- suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth. PLoS One 2008; 3: e2557.

78. Zhao Z, Boyle TJ, Liu Z et al. A negative regulatory loop between microRNA and Hox gene controls posterior identities in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet 2010; 6: e1001089.

79. Cimmino A, Calin GA, Fabbri M et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 13944-13949.

80. Sasayama T, Nishihara M, Kondoh T et al. MicroRNA-10b is overexpressed in malignant glioma and associated with tumor invasive factors, uPAR and RhoC. Int. J. Cancer 2009; 125: 1407–1413.

81. Ma L, Teruya-Feldstein J, Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer. Nature 2007; 449: 682–688.

82. Papagiannakopoulos T, Shapiro A, Kosik KS. MicroRNA-21 Targets a Network of Key Tumor-Suppressive Pathways in Glioblastoma Cells. Cancer Res 2008; 68: 8164-8172.

83. Jiang L, Mao P, Song L et al. miR-182 as a prognostic marker for glioma progression and patient survival. Am J Pathol 2010; 177: 29-38.

84. Liu T, Tang H, Lang Y et al. MicroRNA-27a functions as an oncogene in gastric adenocarcinoma by targeting prohibitin. Cancer Lett. 2009; 273: 233-242.

85. Chintharlapalli S, Papineni S, Abdelrahim M et al. Oncogenic microRNA-27a is a target for anticancer agent methyl 2-cyano-3,11-dioxo-18beta-olean-1,12-dien-30- oate in colon cancer cells. Int J Cancer 2009; 125: 1965-1974.

86. Kefas B, Godlewski J, Comeau L et al. microRNA-7 inhibits the epidermal growth factor receptor and the Akt pathway and is down-regulated in