Dopo aver ottenuto le immagini, queste possono essere sovrapposte e allineate per poterle analizzare meglio attraverso il software Progenesis Same Spot, che è in grado di individuare e selezionare automaticamente tutti i possibili spot presenti nell’immagine del gel.
Si sceglie un’immagine di riferimento sulla quale verranno allineate le immagini di tutti gli altri gel, poi si passa alla fase di filtering in cui si scarta tutto ciò che non è riconducibile a uno spot. Successivamente si sceglie il tipo di analisi: in questo caso è stato fatto un confronto tra i campioni salivari dei soggetti prima dell’inizio del trattamento e alla fine del programma terapeutico, evidenziando così le differenze tra i vari spot nelle due condizioni.
L’intensità di ogni spot è misurata come volume normalizzato e la significatività della differenza del volume per ogni spot viene calcolata dal programma stesso, che include l’analisi statistica ANOVA: si evidenziano le differenze statisticamente significative come il p-value, il q-value e la variazione (fold) della densità ottica degli spot a confronto.
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CAPITOLO 4: RISULTATI E CONCLUSIONI
La tossicodipendenza si sviluppa come risultato di una somministrazione a lungo termine di sostanze che hanno un potenziale d’abuso; è una condizione cronica e recidivante caratterizzata da una compulsiva auto-somministrazione della droga nonostante le conseguenze negative. L’eroina, legandosi soprattutto ai recettori oppioidi μ localizzati nel sistema nervoso centrale, dà dipendenza a causa dei suoi immediati effetti euforizzanti, dovuti a loro volta all’attivazione del sistema mesolimbico e al rilascio di numerosi neurotrasmettitori. Non meno importanti sono gli effetti a lungo termine, per esempio a livello vascolare, osseo e cerebrale, come anche la morbidità a cui sono sottoposti i soggetti tossicodipendenti. Infatti l’uso di eroina aumenta il rischio di contrarre malattie come l’HIV, le epatiti ed altre infezioni; inoltre i soggetti possono cominciare a manifestare dei disturbi psichici. È stato dimostrato che alcuni disturbi psichici possono essere anche la causa della dipendenza da una sostanza come l’eroina, che viene assunta per alleviare i sintomi di queste patologie; altri fenomeni da non sottovalutare come fattori scatenanti della dipendenza sono la povertà, l’esclusione sociale, la scarsa educazione o l’aver vissuto degli eventi traumatici.
Il metadone, che agisce come un agonista oppioide, è il farmaco maggiormente utilizzato per il recupero dei pazienti tossicodipendenti, somministrandolo a dosi alte e stabilizzate in modo da bloccare gli effetti euforizzanti dell’eroina ed eliminare il desiderio di assumere la droga. Il trattamento a lungo termine aiuta anche la reintegrazione sociale dei pazienti e fa diminuire il rischio di morbidità e mortalità, anche se si possono sviluppare ugualmente fenomeni di tolleranza e si possono anche avere casi di overdose. In questa tesi abbiamo voluto valutare l’esistenza di variazioni dei profili proteomici salivari nei soggetti tossicodipendenti sottoposti al trattamento con metadone e verificare l’esistenza di una possibile correlazione tra psicopatologa della dipendenza e profilo molecolare. L’analisi proteomica della saliva dei soggetti tossicodipendenti è stata condotta come studio pilota su 5 pazienti, che hanno fornito i loro campioni prima dell’ingresso nel programma di trattamento con metadone (T0) e dopo sei mesi di trattamento (T1). Il prelievo salivare è stato sempre fatto al mattino prima di colazione. Le caratteristiche demografiche dei soggetti ed i loro inquadramenti secondo i domini psicopatologici sono riportati in Tabella 4. Al momento dell’ingresso nello studio, tutti e cinque i pazienti dichiaravano di non fare uso di altre droghe o farmaci con effetti sul sistema nervoso
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centrale. Gli esami ematochimici non hanno evidenziato la presenza di patologie significative e tutti i pazienti sono risultati negativi per HBV, HCV ed HIV. Nei controlli periodici effettuati sulle urine durante i sei mesi di terapia, i pazienti M001, M002 e M003 sono risultati saltuariamente positivi alla cocaina; il paziente M004 è sempre risultato negativo ad ogni tipo di sostanza d’abuso ricercata nelle urine. Si sospetta invece che il paziente M005 facesse uso di altre droghe perché, negli ultimi due mesi di trattamento, non ha voluto lasciare i campioni delle sue urine. Inoltre, durante il periodo in cui i pazienti sono rimasti nel programma terapeutico non sono stati fatti test sull’uso/abuso di alcool e/o cannabis.
Il profilo proteico salivare, analizzato mediante 2-DE, è stato ampiamente preso in esame, nell’ambito di precedenti ricerche svolte per evidenziare biomarcatori di malattia, dal gruppo di ricerca nel cui laboratorio ho svolto la mia tesi di laurea [102-111]. Pertanto, anche in assenza di un’identificazione non equivoca di una proteina mediante la spettrometria di massa (MS/MS), è stato possibile attribuire una presunta identificazione ai vari spot proteici presenti nei gels bidimensionali.
Inoltre nell’analisi comparativa tra gels, le densità ottiche di alcuni spots appartenenti alla stessa proteina, che differiscono tra loro per il pI, sono stati analizzati sommando i valori delle densità ottiche normalizzate, con lo scopo di valutare la loro espressione complessiva. Al contrario non sono state sommate le densità ottiche di spot che, nonostante appartenessero alla stessa proteina, mostravano andamenti discordanti. Prima di confrontare i campioni di ciascun paziente al T0 e al T1 e mettere in evidenza le eventuali variazioni del proteoma salivare a seguito del trattamento con metadone, abbiamo voluto confrontare il profilo proteomico dei tossicodipendenti al T0 con quello dei 13 controlli sani (Figura 18, Tabella 6).
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Il confronto ha messo in evidenza che nei 5 soggetti tossicodipendenti è presente un decremento delle catene pesanti α delle immunoglobuline (catene pesanti delle IgA), dei loro frammenti, delle catene leggere κ e λ delle immunoglobuline, delle catene J e dei recettori delle immunoglobuline polimeriche (Figura 18, Tabella 6).
Le IgA sono le immunoglobuline presenti normalmente nelle secrezioni e quindi anche nella saliva ed hanno la funzione di prima protezione contro i patogeni a livello delle mucose del nostro organismo. Sono in forma dimerica, contengono la catena J che stabilizza il dimero e una componente secretoria che è una porzione dei recettori per le immunoglobuline polimeriche presenti sulla membrana delle cellule epiteliali.
209 390 389 718 202 392 201 198 217 623 621 504 617 1486 814 895 871 950 959 987 986 921 933 931 944 882 1048 1215 1484 1485
Figura 18 – Immagine rappresentativa di un pattern salivare con codice numerico e posizione degli spot risultati differenzialmente espressi nell’analisi tra controlli sani e pazienti
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# Proteins Anova (p) Fold
Average Normalised Volumes
Controlli Tossicodipendenti (T0)
198 Recettore delle Ig polimeriche 0,017 1,8 1,23E+06 6,80E+05 201 Recettore delle Ig polimeriche 0,018 1,7 1,82E+06 1,05E+06 202 Recettore delle Ig polimeriche 0,002 1,9 2,13E+06 1,10E+06 209 Recettore delle Ig polimeriche 2,74E-05 2,1 2,73E+06 1,28E+06 217 Recettore delle Ig polimeriche 0,003 1,9 2,73E+06 1,43E+06
389 Igα (IGHA) 0,033 1,6 2,24E+06 1,40E+06
390 Igα (IGHA) 0,05 1,5 2,56E+06 1,69E+06
392 Igα (IGHA) 0,048 1,7 3,11E+06 1,85E+06
504 0,018 1,5 8,63E+05 5,59E+05
617 Actina 4,17E-04 3,1 1,16E+06 3,69E+05
621 Actina 8,69E-05 3,7 3,11E+06 8,45E+05
623 Actina 2,41E-04 3,7 2,66E+06 7,19E+05
718 0,034 2,7 9,92E+05 3,62E+05
814 0,005 2,3 4,21E+05 1,87E+05
871 14-3-3 6,86E-05 4 6,35E+05 1,57E+05
882 Igλ/κ (IGLC/IGKC) 0,007 2,4 4,60E+05 1,95E+05
895 14-3-3 0,003 2,1 3,13E+05 1,46E+05
921 Igλ/κ (IGLC/IGKC) 0,009 1,5 2,66E+06 1,81E+06
931 Igλ/κ (IGLC/IGKC) 0,012 1,6 9,37E+06 5,90E+06
933 Igλ/κ (IGLC/IGKC) 2,22E-04 2,1 1,22E+06 5,69E+05
944 Igλ/κ (IGLC/IGKC) 0,006 1,9 6,32E+06 3,35E+06
950 Catena J delle Ig 0,005 1,9 1,32E+06 6,78E+05
959 Catena J delle Ig 0,006 1,7 3,58E+06 2,15E+06
986 Glutatione S Transferasi 0,006 1,9 5,59E+05 2,94E+05 987 Glutatione S Transferasi 0,011 1,8 2,98E+05 1,66E+05
1048 0,013 2,5 2,70E+05 1,07E+05
1215 0,029 1,8 1,35E+06 7,31E+05
1484 Precursore della Cistatina SN 0,048 2,3 4,69E+06 2,07E+06
1485 Igα (IGHA) 0,038 1,5 8,09E+06 5,43E+06
1486 Cheratina 0,073 1,5 5,67E+05 3,71E+05
Tabella 6 – Tabella riassuntiva del confronto tra il proteoma salivari dei 13 controlli sani e quello dei pazienti tossicodipendenti al T0
Questa riduzione di tutte le componenti delle IgA dimeriche salivari ci sta ad indicare che nei soggetti tossicodipendenti è presente una compromissione della risposta immunitaria umorale sicuramente a livello delle mucose. La nostra osservazione è supportata da svariati lavori [22] che riportano una riduzione della risposta immunitaria nei tossicodipendenti.
Va segnalato che dal confronto tra controlli e pazienti tossicodipendenti è anche emersa una riduzione dell’actina, della proteina 14-3-3, della glutatione S transferasi e del precursore della cistatina SN. L’actina è una proteina del citoscheletro cellulare che deriva dalle cellule epiteliali della mucosa orale che si sfaldano e vanno incontro a lisi. La
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proteina 14-3-3, di cui ne esistono varie isoforme, è una proteina di regolazione intracellulare che è capace di interagire con una moltitudine di proteine di segnalazione tra cui chinasi, fosfatasi e recettori di membrana. La glutatione S transferasi appartiene ad una grande famiglia di enzimi intracellulari molto abbondanti che coniugano il glutatione con una varietà di composti che contengono centri elettrofilici. La saliva umana contiene diversi inibitori delle cisteine proteasi, tra cui la cistatina SN che è immunologicamente correlata alla cistatina S. Entrambe queste cistatine inibiscono la papaina, la dipeptidil peptidasi I e la ficina.
Successivamente abbiamo confrontato il profilo proteico salivare dei tossicodipendenti al T0 con quello al T1. La prima osservazione di carattere generale, che è stato possibile fare, è stata la disomogeneità dei profili proteici salivari dei tossicodipendenti dopo 6 mesi di trattamento con metadone, mentre, al contrario, i profili dei 5 pazienti al T0 erano abbastanza omogenei. Questo può essere da ascrivere alla diversa risposta a livello molecolare e biochimico dei singoli pazienti sia allo stress dovuto alla sospensione dell’eroina sia soprattutto al trattamento con metadone. D’altra parte non si può escludere la presenza di altri fattori di confondimento quali l’uso più o meno costante da parte di alcuni pazienti di alcool e/o cannabis come sostanza di rifugio per sopportare la sospensione dell’eroina. Infatti, mentre nell’urina dei pazienti venivano periodicamente ricercate sia cocaina che eroina, la presenza di alcool e cannabis non veniva saggiata in nessun liquido biologico. D’altra parte è noto che l’uso di alcool può interferire, in alcune circostanze, con la biodisponibilità ed il metabolismo del metadone [112].
Vista la disomogeneità dei profili proteici salivari dei pazienti al T1 è stato deciso di effettuare due diversi tipi di valutazione, una qualitativa ed una quantitativa. Nella valutazione quantitativa abbiamo evidenziato la differenza di espressione di proteine risultate significativamente variate in almeno tre pazienti su cinque, mentre nell’analisi qualitativa abbiamo invece deciso di evidenziare le particolarità più evidenti riscontrate individualmente nei diversi pazienti.
L’analisi quantitativa ha evidenziato un’ulteriore diminuzione delle catene α delle IgA, dei loro recettori e delle catene J delle immunoglobuline nei pazienti dopo sei mesi di trattamento con metadone (Figura 19, Tabella 7). Il confronto tra i profili proteici salivari a T0 e T1 ha anche evidenziato un decremento delle catene μ delle IgM, che rappresentano la risposta immunitaria umorale primaria, a seguito del trattamento con metadone. Questi dati suggeriscono che sei mesi di terapia con metadone inducono un ulteriore compromissione della risposta immunitaria umorale.
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Figura 19 - Istogramma riassuntivo dei risultati ottenuti per le proteine della risposta immunitaria umorale nei pazienti tossicodipendenti prima del trattamento con metadone (T0)
e dopo sei mesi di trattamento (T1)
T0 T1
Media SD N° Media SD N° Recettore delle Ig Polimeriche 0,033132 0,005481 5 0,029472 0,014273 5
Igα (IGHA) 0,108516 0,01444 5 0,091225 0,032862 5 Igκ/λ (IGKC/IGLC) 0,126166 0,030285 5 0,156158 0,045722 5 Igμ 0,006546 0,007354 3 0,002007 0,000769 3 Catena J delle Ig 1 0,002348 0,001182 5 0,001829 0,000956 5 Catena J delle Ig 2 0,007051 0,003927 5 0,006653 0,003206 5 Catena J delle Ig 3 0,008637 0,005321 5 0,010974 0,005085 5
Tabella 7 – Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti per le proteine della risposta immunitaria umorale nei pazienti tossicodipendenti prima del trattamento con metadone (T0) e dopo sei
mesi di trattamento (T1)
Al contrario, abbiamo potuto riscontrare un incremento dell’albumina, della tioredossina, della proteina indotta dalla prolattina (PIP) e di alcune cistatine nella saliva dei pazienti dopo sei mesi di terapia disintossicante (Figura 20, Tabella 8; Figura 21, Tabella 9).
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Figura 20 - Istogramma riassuntivo dei risultati ottenuti per le proteine salivari tioredossina, albumina e proteina induttore della prolattina nei pazienti tossicodipendenti prima del
trattamento con metadone (T0) e dopo sei mesi di trattamento (T1)
T0 T1
Media SD N° Media SD N° Albumina 0,019278 0,009833 4 0,025246 0,009074 5
Tioredossina 0,005609 0,002088 5 0,00925 0,004562 4
Proteina Indotta dalla Prolattina 0,003599 0,001755 5 0,006152 0,003371 5
Tabella 8 - Tabella riassuntivo dei risultati ottenuti per le proteine salivari tioredossina, albumina e proteina induttore della prolattina nei pazienti tossicodipendenti prima del
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Figura 21 – Istogramma riassuntivo dei risultati ottenuti per vari tipi di cistatine salivari nei pazienti tossicodipendenti prima del trattamento con metadone (T0) e dopo sei mesi di
trattamento (T1) T0 T1 Media SD N° Media SD N° Cistatina S/SN/SA 0,083769 0,021234 4 0,095289 0,022275 4 Precursore Cistatina SN 0,017022 0,007513 4 0,049535 0,018279 4 Cistatina A 0,006783 0,007248 5 0,009111 0,012576 5 Cistatina B 0,006559 0,001084 3 0,011585 0,002272 3 Cistatina C 0,001199 0,000991 3 0,001429 0,001342 3
Tabella 9 - Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti per vari tipi di cistatine salivari nei pazienti tossicodipendenti prima del trattamento con metadone (T0) e dopo sei mesi di trattamento
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Per quanto riguarda l’albumina (Figura 20), la proteina plasmatica che rappresenta approssimativamente il 50% di tutte le proteine ematiche, c’è da segnalare che è la principale proteina che lega il metadone nel sangue e quindi un aumento della sua concentrazione porta ad un aumento della quantità del farmaco che viene trasportato [113]. La PIP (Figura 20) è una piccola glicoproteina che viene secreta da varie cellule apocrine, incluse le cellule acinose delle ghiandole salivari. Si lega a varie proteine, ma il suo ruolo in queste interazioni non è ben chiaro, sebbene sembra che abbia una funzione immunomodulante soprattutto sull’immunità adattativa cellulo-mediata. L’espressione di questa proteina viene indotta a livello trascrizionale dalla prolattina, dall’ormone della crescita, dagli androgeni, dal progesterone, dai glucocorticoidi e da alcune citochine come IL-1α, IL-4 ed IL-13, mentre viene inibita dal 17-estradiolo e da IL-6 [114]. Sappiamo che nel corso della tossicodipendenza da eroina si instaura un’alterazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene che può in parte spiegare la compromissione delle risposte immunitarie adattative e che potrebbe portare anche ad un aumento dell’espressione di PIP. Tuttavia noi notiamo un marcato aumento dell’espressione di questa proteina dopo sei mesi di trattamento con metadone il che sembra concordare con un’ulteriore compromissione delle risposte adattative di tipo umorale come evidenziato dal decremento delle varie componenti delle IgA salivari. Dati preliminari, non riportati in questa tesi di laurea, indicano che dopo nove mesi di trattamento con metadone si può osservare un decremento dei livelli salivari di PIP.
La tioredossina (Figura 20) è una piccola proteina a localizzazione intracitoplasmatica (isoforma 1), che in alcune circostanze può anche essere secreta e che svolge un ruolo chiave come regolatore dei processi “redox” associati allo stress ossidativo. Inoltre gioca un ruolo nella regolazione dello stress indotto da NO. Attraverso la regolazione di vie di segnalazione cellulari dipendenti dallo stato “redox” e dalla S-nitrosilazione, la tioredossina ha un importante ruolo nel mantenere un ambiente fisiologico per le cellule ed inoltre interagisce con un ampio numero di diverse proteine [115]. L’incremento della tioredossina nei pazienti trattati per sei mesi con metadone potremme suggerire una risposta cellulare allo stress ossidativo. D’altra parte è noto che la morfina ha effetti farmacologici associati con lo stato “redox” cellulare ed è stato riportato che le cellule SH-SY5Y esposte alla morfina mostrano un incremento dell’espressione della tioredossina [116]. Per quanto riguarda le cistatine (Figura 21) che mostrano anch’esse un incremento al tempo T1 va segnalato che questi inibitori proteici delle cisteine proteasi
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svolgono quattro principali funzioni nella saliva: 1) inibizione di cisteine proteasi endogene ed esogene; 2) modulazione del sistema immune; 3) attività anti batterica ed anti virale che può non essere correlata all’inibizione delle cisteine proteasi; 4) controllo della mineralizzazione della superficie dei denti [117]. Questo incremento delle cistatine sembra andare nella stessa direzione della variazione di PIP ed entrambi potrebbero rappresentare una reazione locale di contrasto alla riduzione della risposta immunitaria adattativa delle superfici mucose.
Dal punto di vista qualitativo, osservando i profili salivari risulta evidente che alcuni spot mostrano andamenti differenti nei 5 pazienti. Come esempio emblematico riportiamo la variazione del livello di α-amilasi salivare in ogni singolo paziente a seguito del trattamento farmacologico con metadone (Figura 22). L’α-amilasi (isoforma salivare) è un enzima abbondantemente rappresentato nella saliva dove svolge il ruolo di idrolasi dei legami α 14 glicosidici dell’amido e quindi contribuisce alla digestione di questo polisaccaride. Nel proteoma salivare sono normalmente presenti diverse forme dell’enzima che probabilmente derivano da modificazioni post-taduzionali. I soggetti M004 e M002, appartenenti entrambi al gruppo “sensibilità psicoticismo” mostrano un lieve incremento dell’espressione dell’enzima dopo il trattamento con metadone mentre i soggetti M003 e M001, che appartengono al gruppo “ansia panico”, mostrano invece una lieve riduzione. Infine, il soggetto M005 appartenente al dominio “violenza suicidio” mostra una riduzione pronunciata dell’enzima al T1. E’ evidente che un’analisi più approfondita delle variazioni di singole proteine salivari all’interno dello stesso individuo potrebbe suggerire una possibile correlazione tra psicopatologia e risposta molecolare al trattamento detossificante. Chiaramente per supportare una tale ipotesi sarà necessario estendere lo studio ad un numero maggiore di soggetti. Tale studio potrebbe anche suggerire possibili biomarcatori salivari predittivi della risposta al trattamento.
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Figura 22 - Grafico e immagini che evidenziano la netta diminuzione dell'α-amilasi nel soggetto M005 rispetto agli altri 4 pazienti
Conclusioni
Questo studio pilota ha permesso di evidenziare variazioni dei profilo proteomico salivare di soggetti tossicodipendenti in trattamente con metadone. Incoraggiati dai risultati ottenuti su questo piccolo campione di soggetti, coscienti anche dell’esistenza di possibili, numerosi fattori confondenti, ci proponiamo di estendere l’indagine ad un numero maggiore di pazienti sottoposti al trattamento farmacologico per sei mesi ed anche per un periodo più lungo di tempo.
T0
T1
M005 M002 M00361
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