Microsatelliti
A questo punto del lavoro i dati molecolari ottenuti devono essere analizzati per mezzo di analisi statistiche che possibilmente forniscano risultati semplici e immediati da interpretare. I dati relativi ai polimorfismi dei microsatelliti visionati e corretti con GENEMAPPER® v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA) sono stati quindi analizzati mediante l'uso di differenti software per le analisi di dati molecolari.
Per individuare la possibile presenza di alleli nulli (cioè alleli accidentalmente non amplificati), errori dovuti a slippage durante la replicazione nella PCR che generano piccoli picchi secondari (stuttering), errori causati da mancata amplificazione di un allele in individui eterozigoti (dropout) o da deviazioni dal repeat atteso, ho utilizzato il software MICROCHECKER v 2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) con un intervallo di confidenza del 95% (10.000 ripetizioni).
Successivamente i loci microsatelliti sono stati testati con il software GENEPOP v 4.0 (Raymond & Rousset, 1995) per l’equilibrio di Hardy-Weinberg (HWE) con il metodo Markov chain o MC (Guo e Thompson, 1992) e per l’assenza di genotypic
Linkage disequilibrium (LD) (indipendenza nella segregazione dei loci) applicando il
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(FDR) (Narum, 2006) adottando il metodo di Benjamini & Hochberg (1995) che è un modo alternativo a quelli conosciuti come Bonferroni o chi-quadrato di correggere test multipli. Ad oggi il metodo FDR è in grado di fornire il valore critico più importante biologicamente per valutare la significatività delle differenze biologiche tra popolazioni (Procházka et al., 2011). Freena (Chapuis & Estoup, 2007; Liu et al, 2013) è stato utilizzato per ricalcolare le frequenze alleliche tenendo conto degli alleli nulli. Questo programma restituisce delle frequenze alleliche modificate rispetto all’originale correggendo in modo efficace l’influenza esercitata dalla presenza di alleli nulli sulla stima degli indici come l’ FST.
Con il software CERVUS (Kalinowski & Marshall, 2007) ho calcolato per ogni
locus l’eterozigosità osservata (Ho), attesa (He) e il PIC (polymorphic information
content) cioè il grado di informatività di un locus polimorfico. Secondo Botstein et al.
(1980), i valori di PIC che superano 0,50 indicano un locus molto informativo, i valori che vanno da 0,50 a 0,25 un locus mediamente informativo, mentre i valori sotto 0,25 un locus non informativo. Per ogni microsatellite ho determinato inoltre il numero di alleli, il range allelico e la dimensione delle ripetizioni.
La statistica descrittiva è stata calcolata con i software MSA v. 4.05 (Dieringer & Schlötterer, 2003) e GENETIX v. 4.05 (Belkhir et al., 2004). Ho calcolato per i microsatelliti il numero di genotipi totale e per popolazione, il numero di alleli per popolazione, le frequenze alleliche per popolazione e la ricchezza allelica (Ar) cioè il numero di alleli nella popolazione corretta per le dimensioni del campione. Ho ottenuto i valori di eterozigosità attesa (He) e osservata (Ho) per popolazione: parametri
dipendenti dalla distribuzione delle frequenze alleliche che possono assumere valori da zero (assenza di eterozigosità) a uno (sistema con un grande numero di alleli a frequenze simili). L’Ho è la proporzione di individui eterozigoti osservata per ciascun
locus analizzato rispetto al totale degli individui. He invece è la probabilità che un
genotipo preso a caso da una popolazione sia eterozigote ad un certo locus quando la popolazione risulta in equilibrio di H-W.
Con il programma FSTAT v. 2.9.3 (Goudet, 2001) ho calcolato per mezzo di 10.000 permutazioni uno dei parametri della statistica F di Wright (Wright, 1951): il valore FIS (coefficiente di consanguineità, di inbreeding o di inincrocio degli individui
delle sottopopolazioni). Tale indice individua eccesso di omozigoti (o riduzione di eterozigoti o Wahlund effect) rispetto all’atteso. Esso è una misura della deviazione dall’equilibrio di H-W nelle sottopopolazioni e varia da -1 a +1 dove 0 indica
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l’equilibrio. FIS assume valori positivi in caso di carenza di eterozigoti rispetto all’atteso
indicando presenza di inbreeding, mentre assume valori significativamente negativi in caso di eccesso di eterozigoti e outbreeding.
Diversità tra le popolazioni
Per misurare le differenze tra le popolazioni un altro indice utile proveniente dalla statistica F è l’ FST. Nello specifico esso è un indice di distanza genetica tra le
popolazioni, una misura della deriva genetica e della perdita di eterozigosità per discostamento dalla panmissia, frammentazione della popolazione, aumento dell’inincrocio o altre cause. Esso rappresenta la probabilità di estrarre casualmente da un gruppo di individui due alleli diversi rispetto alla stessa probabilità su tutta la popolazione. FST costituisce quindi la componente tra popolazioni della varianza
genetica totale. Il suo valore può variare da 0 (panmissia) a 1 (massima differenziazione tra le popolazioni), non è mai negativo e al crescere di FST aumenta il grado di
differenziazione tra le popolazioni cioè la struttura. L’indice FIT infine misura la
deviazione da H-W per il totale degli individui infatti è il coefficiente di consanguineità complessivo calcolato sulla popolazione totale che comprende sia FST sia FIS.
I tre indici si calcolano:
FIS = (Hs-Ho)/Hs,
FIT= (Ht- Ho)/Ht,
FST = (Ht-Hs)/Ht,
dove Ho è la frequenza di tutti gli eterozigoti, Hs e Ht rappresentano l’ eterozigosità attesa sotto l’equilibrio di H-W all’interno delle popolazioni e in tutta la popolazione complessiva con accoppiamento casuale (Nei, 1973).
Essi sono quindi collegati dalla formula:
FIS = (FIT – FST) / (1 –FST).
L‘indice FST globale, i pairwise FST (Weir & Cockerham 1984) tra tutte le
possibili coppie di popolazioni e l’analisi della varianza molecolare AMOVA (Excoffier, et al. 1992) sono stati calcolati con il software ARLEQUIN v. 3.5.1 (Excoffier et al., 2010). Per studiare la variazione molecolare all’interno dell’intera popolazione è stata calcolata l’analisi della varianza molecolare AMOVA locus per locus su una matrice di distanze. Tale analisi lavora distribuendo su scala gerarchica la varianza molecolare e in
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questo studio è stata svolta su tre livelli, calcolando la componente della varianza molecolare tra i gruppi (FCT), tra le popolazioni entro i gruppi (FSC) e all’interno delle popolazioni (FST). L’ AMOVA è stata calcolata sia per tutti gli individui in un gruppo sia a due e tre gruppi. Nello specifico la suddivisione in due gruppi si basa su una separazione geografica in cui da una parte sono state raggruppate le due popolazioni delle Canarie (FV, GC) e nel secondo gruppo tutte le popolazioni restanti. Il calcolo effettuato dividendo in tre gruppi gli individui separa invece le sottospecie: le sottospecie insularum e distinctus in un primo gruppo, la sottospecie saharae in un secondo e la sottospecie oedicnemus in un terzo gruppo. Nel particolare sono state incluse SI, BA, GR, TU nella sottospecie saharae e TA, TO, SD, UK, VE nella sottospecie oedicnemus. La significatività della statistica F è stata valutata tramite randomizzazione con 1.000 permutazioni ed è stata corretta usando l’ FDR (metodo Benjamini & Hochberg, 1995).
Le relazioni di affinità tra gli individui sono state indagate con il pacchetto adegenet del software R versione 1.3-6 (Jombart, 2008) per mezzo dell’analisi delle componenti principali (PCA; Pearson K., 1901).
E’ stato poi utilizzato un approccio Bayesiano per analizzare la struttura di popolazione e svolgere un test di assegnazione. A differenza della statistica classica, gaussiana, che lega il concetto di probabilità a quello di frequenza relativa o proporzione, nell’approccio Bayesiano tale concetto è legato alla plausibilità che eventi dall’esito incerto possano accadere o che proposizioni possano risultare vere. Il nome di questo approccio deriva dal teorema di Bayes che ne costituisce il fondamento. Questo metodo ha ampia applicazione poichè agisce operando una stima del grado di confidenza di un’ipotesi prima di osservare i dati per poi associare un valore numerico al grado dopo l’osservazione dei dati. Analisi di questo tipo, che ricercano la presenza di gruppi genetici indipendenti (K) all’interno del dataset, sono state condotte utilizzando il programma STRUCTURE v. 2.3.4 (che si basa sull’algoritmo elaborato da Pritchard et al. 2000). I dati sono stati analizzati per K (1-10) per 3 volte utilizzando l’
admixture model e le frequenze alleliche correlate (1.000.000 iterazioni MCMC di cui le
prime 200.000 scartate come burn in). Inoltre ho applicato il modello LOCPRIOR, incorporato in STRUCTURE, il quale assume che gli individui campionati insieme sono spesso della stessa popolazione e possono essere di supporto al momento della formazione dei clusters quando la struttura di popolazione è debole. Per individuare il numero più probabile di gruppi genetici (K) nel nostro campione è stato determinato il
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deltaK(K) in Structure Harvester 0.56.3 (Dent, 2012) come indicato da Evanno et al. (2005). CLUMPP v. 1.1.2 (Jakobsson & Rosenberg, 2007) è stato utilizzato per stimare il numero di ripetizioni identiche per K. La rappresentazione grafica è stata ottenuta con Microsoft Excel.
Dispersione e migrazione
Per lo studio del fenomeno della dispersione si è usato il programma FSTAT per il calcolo degli FST divisi per sessi e GENETIX per il calcolo dell’indice FIS per sesso per
ogni popolazione. Ci si aspetta che i valori di FST siano maggiori per il sesso filopatrico
e minori per quello che disperde mentre in generale si dovrebbe ottenere un FIS più alto
per il sesso che disperde. Per il calcolo di questi due indici si è usato il metodo di Weir & Cockerham (1984) poiché è il più utilizzato per questo scopo. Il valore r di
relatedness, AIc medio (mAIc) e la varianza di AIc (vAIc) sono stati calcolati con
FSTAT. Il valore di relatedness (r) è correlato con FST per mezzo della relazione:
r = 2 F
ST/ (1 + F
IT)
(Hamilton, 1971) perciò ci si attende lo stesso risultato per entrambi gli indici.
Il valore AIc (Assignment Index) rappresenta la probabilità Pij che il genotipo di un individuo j in una data località K al locus i appaia nel campione k-esimo. Esso sarà un valore positivo per quei genotipi con maggiore probabilità di essere presenti rispetto alla media (individuo filopatrico), negativo per quelli che hanno un genotipo meno probabile della media (individui che disperdono). Il calcolo del AIc medio (mAIc) e della varianza di AIc (vAIc) ci dà ulteriori informazioni: il sesso che disperde maggiormente mostra un valore di mAIc più basso di quello residente.
Per avere una stima indiretta del flusso genico che potrebbe essersi verificato in passato tra le popolazioni si è usato il software GENEPOP per il calcolo del valore Nem
(Numero assoluto di Migranti per generazione). Esso si basa sulle differenze genetiche tra popolazioni e assume l’equilibrio deriva-migrazione del Modello ad Isole (Slatkin, 1985). Siccome il valore Nem è correlato con quello di FST, all’aumentare del valore di
FST si avranno Nem più bassi. Al contrario con FST bassi i valori Nem crescono. Quando
Nem=0 non ci sono migranti, gli alleli sono fissati in tutte le popolazioni dalla deriva
genetica e le popolazioni divergono; quando Nem>1 avvengono scambi tra le
popolazioni che quindi risultano simili senza divergenza dovuta a drift. Poiché il Modello ad Isole parte da assunzioni che generalmente sono violate nelle popolazioni reali, i risultati di questa analisi devono essere interpretati con la dovuta cautela.
40 DNA mitocondriale
Sui dati relativi alle sequenze mitocondriali ho calcolato il numero di aplotipi, la diversità aplotipica (H) e la diversità nucleotidica (π) globali e per ogni popolazione attraverso il programma DnaSP v. 5 (Librado & Rozas, 2009). La diversità aplotipica consiste nel numero e abbondanza di alleli diversi presenti in una popolazione. Nello specifico essa è la diversità genetica cioè la probabilità che due individui estratti a caso nella popolazione abbiano diversi aplotipi (Nei, 1987) Essa si calcola:
H = N(1-Σx
i²)/(N-1),
dove N è il numero totale di aplotipi e xi corrispondente alla frequenza dello i-esimo
aplotipo del locus.
Per il confronto tra aplotipi e popolazioni la distanza genetica più semplice è rappresentata dalla divergenza in nucleotidi tra due sequenze.
Essa si calcola (Nei, 1987):
π=
ij/[n(n-1)],
dove ij è la proporzione di nucleotidi differenti per sito fra i due aplotipi i e j calcolata
su tutti i confronti a coppie e n è il numero di aplotipi.
La distribuzione degli aplotipi principali è stata calcolata come percentuale per ogni popolazione e rappresentata su una mappa geografica.
Per saggiare l’evoluzione neutrale delle sequenze, ho effettuato il D-test di Tajima (Tajima, 1989) tramite ARLEQUIN, in grado di misurare quanto i patterns di diversità molecolare osservati (in numero di mutazioni) si discostano da quelli attesi in condizioni di equilibrio mutazionale neutrale. Esso assume che una popolazione in equilibrio mutazionale neutrale mantenga una dimensione costante quindi oggi è ampiamente utilizzato come ‘indicatore’ dei cambiamenti demografici. In caso di un cambiamento demografico recente, ad esempio un’espansione, ci si attende di ottenere un valore altamente negativo e significativo mentre ci si aspetta un valore uguale a zero quando gli incroci avvengono a caso (random mating) e la popolazione è in equilibrio mutazionale neutrale. Ho effettuato in seguito i test Fs di Fu (Fu, 1996) e R2 (Ramos- Onsins & Rozas, 2002) per popolazione per mezzo di ARLEQUIN e DnaSP e la significatività di R2 è stata calcolata tramite 5000 simulazioni di coalescenza in DnaSP. Solo i valori significativamente negativi per Fs e positivi per R2 sono tenuti in considerazione come evidenza di espansione demografica. Infine è stata esaminata in ARLEQUIN la Mismatch Distribution (MD) delle distanze a coppie che confronta i
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parametri osservati con quelli attesi sotto il modello di espansione demografica. La somma dei quadrati delle differenze tra osservati e attesi (SSD) è stata utilizzata come test per la deviazione dal modello di espansione in ogni popolazione. Tutti questi indici sono stati calcolati solo per il segmento ND2 perché è quello con il maggior numero di individui sequenziati per popolazione.
Diversità tra le popolazioni
Per indagare la diversità tra popolazioni o clusters e formulare ipotesi sulla loro differenziazione sono stati calcolati gli FST a coppie in ARLEQUIN e la loro
significatività è stata valutata tramite randomizzazione e con 1000 permutazioni.
Per permettere di valutare se due sequenze oggetto di studio possano essere unite nelle successive analisi basandosi sull’omogeneità dei tassi di mutazione ho effettuato il Partition Homogeneity Test (PHT) (ATP:1-331, ND2:332-., p>0,05) per mezzo del programma PAUP v. 4.0 (Swofford, 2001). In seguito ho condotto l’analisi della varianza molecolare (AMOVA) sia su frequenze aplotipiche sia su distanze nucleotidiche sia per il dataset di sequenze ND2 da solo, ATP6/8 da solo sia per il file concatenato ATP6/8+ND2. La significatività della statistica F è stata corretta usando l’FDR del metodo Benjamini & Hochberg (1995).
Ricostruzione filogenetica
Per costruire un network che mostri le relazioni tra gli aplotipi usando il metodo della massima parsimonia (Maximum Parsimony-MP) ho utilizzato il pacchetto pegas del software R. Questo metodo si utilizza preferibilmente quando è presente poca variabilità nelle sequenze o quando i nodi non sono ben risolti con altri metodi e l’albero che si ottiene non è radicato.
Esso unisce le sequenze identiche in un unico aplotipo e calcola la frequenza di ciascun aplotipo nel campione. Un algoritmo calcola la distanza tra ogni individuo e gli altri confrontando le variazioni per ogni sequenza. Una volta che la matrice di distanza è stata creata si applica un algoritmo che unisce i taxa in un cladogramma. I due clusters con la minima distanza M saranno poi uniti, mentre le connessioni che hanno una distanza maggiore di 1, verranno costruite con l'aggiunta di intermedi (nodi) fino a formare una rete di aplotipi (network).
I nodi posti come intermedi rappresentano gli aplotipi mancanti perché soggetti a selezione negativa e quindi estinti o perché non sono stati trovati nel campionamento. I
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nodi intermedi all’interno del network rappresentano un evento mutazionale che differenzia un aplotipo dall’altro e permettono di comprendere le relazioni tra gli individui meglio di quanto faccia un albero filogenetico nel quale gli aplotipi si trovano solo alla fine di ciascun ramo.
È stato effettuato il test sul modello evolutivo per mezzo di MODELTEST 3.04 (Posada & Crandall, 1998) il quale seleziona il modello di sostituzione nucleotidica che meglio si adatta al set di dati oggetto di studio su 88 modelli evolutivi possibili. A questo scopo è stato scelto il criterio bayesiano o BIC (Schwarz, 1978). Seguendo il criterio di Maximum likelihood (ML) mediante il software PAUP è stato costruito un albero filogenetico radicato. Questo metodo è incluso tra quelli che cercano di ricostruire una filogenesi utilizzando un criterio di ottimizzazione e non solo degli algoritmi. Basandosi su un modello evolutivo, esso stima l’albero migliore quindi quello che ha la più alta probabilità di essere generato sulla base del modello e dei dati. Ha il vantaggio di considerare tutti i dati contemporaneamente (tutte le informazioni della matrice dei caratteri) ed è considerato uno dei metodi che lavora meglio.
L’analisi di tipo bayesiano è stata condotta per mezzo di MrBAYES v. 3.0B4 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001) (4 catene MC-1 heated-3 cold; 2,000,000 di generazioni; frequenza di campionamento 100 generazioni; random starting tree; burn- in 20%). Essa è in grado di confrontare la probabilità a priori prima dell’analisi dei dati con la probabilità a posteriori (cioè la probabilità che il valore di un parametro sia uguale al valore dell’osservazione).
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RISULTATI
MICROSATELLITI
L’amplificazione eterologa ha avuto successo per tutti i nove loci testati nelle 11 popolazioni (151 individui). In seguito al sizing ho escluso dalle analisi statistiche i loci TG01114 e TG11011: il primo perché risultava monomorfico e il secondo perché presentava problemi nella lettura dei picchi (stuttering). I sette loci polimorfici presentavano un numero di alleli da un minimo di 3 (TG01124, TG05030) a un massimo di 10 (TG01040) (Tab 3). L’indice PIC ha mostrato il valore più basso per il
locusTG01124 (0,298) mentre il valore più alto per il locus TG01040 (0,745). Tre loci (TG04004, TG01124 e TG05030) sono caratterizzati da un valore PIC medio (loci mediamente informativi) e quattro loci (TG05053, TG01040, TG01000, TG03002) da un elevato valore PIC (loci molto informativi). Il valore massimo di Ho si trova in
TG03002 (0,613) mentre il più basso (0,336) in TG04004. I valori di He più alti sono
anche quelli che maggiormente sidifferenziano dai valori di Ho (0,750 e 0,778 rispetto a
0,470 e 0,430 di TG05053 e TG01040).
Loci Range allelico (pb) Dimens.
repeat N° alleli PIC Ho He 1 TG05053 200 -206 1 6 0,708 0,470 0,750 2 TG01040 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 1 10 0,745 0,430 0,778 3 TG04004 154, 156, 158, 160 2 4 0,332 0,336 0,404 4 TG01000 185, 187, 189, 191, 193 2 5 0,560 0,557 0,631 5 TG03002 120, 122, 124, 126 2 4 0,565 0,613 0,638 6 TG01114 178 - 1 - - - 7 TG11011 Non assegnabile - - - - - 8 TG01124 385, 389, 391 2 3 0,298 0,353 0,358 9 TG05030 178, 180,182 2 3 0,325 0,338 0,405 Tab 3. Range allelico, dimensioni dei motivi ripetuti (repeat), numero di alleli, grado di informatività dei polimorfismi (PIC- polymorphic information content), eterozigosità osservata (Ho) e attesa (He) per ogni locus amplificato nell’occhione.
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Dalle analisi condotte attraverso il programma MICROCHECKER v 2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) è emerso che alcune popolazioni non sono in equilibrio per qualche locus (Tab 4). Il locus genico TG01040 ha mostrato deviazioni dall’equilibrio in sette popolazioni su 11. Il locus TG05053 ha presentato una situazione analoga esclusivamente in quattro popolazioni, i loci TG01000 e TG03002 invece unicamente in una popolazione. Nessun discostamento dall’equilibrio invece è emerso per le popolazioni FV, GR e VE. TG01000 TG01040 TG03002 TG05053 TG04004 TG01124 TG05030 BA O, A FV GC O, D, A O, S, A SI O, D, A O, A O, S, A TA O, D, A O, S, A TO A TU O, D, A GR SD O, S, A O, A UK O, A VE
Tab 4. Tabella con indicazione delle popolazioni in cui certi loci hanno riportato eccesso di omozigoti (O), stuttering (S), dropout (D) e alleli nulli (A).
Tutti i loci sono risultati in equilibrio di H-W tranne TG01040 che, siccome ha mostrato anche presenza di alleli nulli in quasi tutte le popolazioni (Tab 4), è stato eliminato dalle analisi successive. Per gli altri loci è stata calcolata la frequenza di alleli nulli con Freena e sono stati confrontati i nuovi valori di FST a coppie con gli FST a coppie
ottenuti mantenendo le frequenze alleliche originali. I valori corretti non hanno tuttavia mostrato grosse differenze (<0.05) rispetto a quelli originali perciò è stato mantenuto nelle analisi statistiche seguenti anche il locus TG05053 che da una prima analisi con MICROCHECKER risultava avere alleli nulli in quattro popolazioni. Dopo la correzione FDR dei test multipli nessuna coppia di loci è risultata in linkage
disequilibrium.
Le popolazioni FV, GC, UK e VE hanno mostrato il numero minimo (15) di alleli, mentre TA e TU il massimo (20). La ricchezza allelica (Ar) varia da un minimo di 2.134 in GC a un massimo di 2.620 in SD. I valori di Ho vanno da un minimo di 0.25 in
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un massimo di 0, 526 (UK). I valori di FIS sono risultati significativi per SI (0,196), GR
(0,357) e SD (0,240) indicando che in queste popolazioni c’è un alto numero di omozigoti che potrebbero essersi generati per inbreeding (Tab 5).
POP. N° individui N° alleli Ar Ho He FIS
1 BA 20 18 2,494 0,529 0,510 -0,012 2 FV 5 15 2,359 0,533 0,423 -0,153 3 GC 20 15 2,134 0,441 0,414 -0,039 4 SI 25 19 2,587 0,417 0,506 0,196* 5 TA 27 20 2,435 0,429 0,469 0,104 6 TO 11 17 2,328 0,439 0,416 -0,008 7 TU 17 20 2,528 0,500 0,499 0,029 8 GR 6 16 2,324 0,250 0,344 0,357* 9 SD 7 19 2,620 0,357 0,428 0,240* 10 UK 6 15 2,422 0,450 0,526 0,239 11 VE 7 15 2,393 0,404 0,442 0,160 TOT. 151
Tab 5. Statistica descrittiva degli STR per popolazione: numero di individui, numero totale di alleli, ricchezza allelica (Ar), osservata (Ho), eterozigosità attesa (He) e
coefficiente FIS di inbreeding. Significatività FIS segnata in grassetto con asterisco(*): p-
value ≤ 5%.
Ho rappresentato la frequenza allelica per ogni locus con dei grafici a barre e ho cercato la presenza di alleli privati per popolazione. Sono stati trovati alleli privati in tre popolazioni. Gli alleli “154” e “160” del locus TG04004 sono privati rispettivamente nelle popolazioni TU e UK; l’allele “178” del locus TG05030 risulta privato nella popolazione TA (Fig 12; Tab 6). Inoltre da questi grafici si nota che l’allele “193” del
locus TG01000 è unicamente presente in GC e SD; l’allele “391” del locus TG01124 è
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Fig 12. Grafici delle frequenze alleliche degli STR per locus per popolazione. Gli alleli privati sono segnati in grassetto nelle legende.
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Locus Allele privato Popolazione
TG04004 154 TU
160 UK
TG05030 178 TA
Tab 6. Schematizzazione dei due loci che hanno riportato alleli nulli. Nome del locus, lunghezza dell’allele privato e popolazione in cui è stato trovato.
Diversità tra le popolazioni
I valori degli FST (Tab 7) a coppie per i microsatelliti hanno mostrato in primo luogo che
le due popolazioni delle Canarie hanno FST significativi con tutte le altre popolazioni
tranne che tra di loro indicando che c’è differenziazione tra gli individui di questo arcipelago e quelli delle altre regioni mediterranee e nord europee. Inoltre la media complessiva dei valori significativi delle Canarie è più alta (0,1955) se confrontata con