3. MATERIALI E METODI
3.7. ANALISI STATISTICHE
Per la definizione delle condizioni sperimentali ottimali, le variabili temperatura e concentrazione di proteine sono state analizzate mediante two way-ANOVA e test di Bonferroni.
Le differenze tra trattamenti o condizioni sono state valutate mediante one way-ANOVA e test di Dunnett (controllo VS trattamenti) o test di Tukey (confronto tra condizioni).
I parametri cinetici (Km, Vmax) ed i valori di IC50 sono stati calcolati mediante una analisi di
33
Tutte le analisi sono state svolte mediante Graphpad Prism versione 5.0 per windows, Graphpad software, San Diego, California, USA.
4.
RISULTATI
Ai fini di delineare il profilo di caratterizzazione delle colinesterasi presenti nelle frazioni cellulari S9 ottenute da diversi segmenti corporei di D. neapolitana, è stata condotta una valutazione preliminare che permettesse di individuare i valori ottimali di temperatura e concentrazione di proteine per ottenere le migliori linearità delle cinetiche enzimatiche ed i più alti valori di attività. A questo scopo, sono stati confrontati i turnover enzimatici (espressi come nanomoli di substrato idrolizzato/mg di proteina/minuto) ottenuti usando come substrato ATChI 470 μM, testando due temperature (25 °C e 37 °C) e tre diverse concentrazioni di proteine (0.15, 0.5 e 0.75 mg) all’interno del mix di reazione mantenuto al volume costante di 3,13 mL (Fig. 1).
Figura 16: valutazione della temperatura di incubazione e della concentrazione di proteine ottimale nel mix di reazione in saggi di attività colinesterasica (incubazione 30 min, substrato ATChI 470 μM). Dati espressi come nmol/min/mg proteina (media ±ES; n=3). Lettere diverse indicano differenze significative (p<0.05), two-way ANOVA (test di Bonferroni).
34
I risultati mostrano che, tra le temperature testate, le condizioni che permettono di ottenere i più elevati valori di attività enzimatica sono rappresentate dalla temperatura di 25 °C ed una concentrazione di proteine di 0.15 mg, come confermato dall’analisi two-way ANOVA seguita dal test di Bonferroni (p<0.05). Inoltre, tutti i saggi sono stati svolti monitorando la reazione per 5 e 10 minuti. Dato che non sono emerse differenze significative nella linearità delle cinetiche svolte ai due diversi tempi, per gli altri saggi di attività enzimatica è stato scelto un tempo di 5 minuti.
La Fig. 17 mette a confronto i livelli di attività enzimatica riscontrati con i substrati ATChI 470 μM (ATChI-ChE) e PTChI 1880 μM (PTChI-ChE) nelle frazioni S9 derivanti dai diversi segmenti corporei e dal corpo intero. L’attività ATChI-ChE più alta è stata osservata nei segmenti posteriori, seguiti da quelli intermedi, mentre il livello più basso di attività è stato riscontrato nei segmenti apicali e nel corpo intero. Tuttavia, le differenze tra i segmenti posteriori ed intermedi non sono risultate statisticamente significative. Sono invece risultate significative le differenze sia tra i segmenti posteriori ed apicali che quelle tra i segmenti posteriori ed il corpo intero (p<0.05) (Fig. 17A). L’attività PTChI-ChE osservata nei segmenti posteriori è risultata essere significativamente maggiore (p<0.05) di quella nei segmenti apicali, ma non significativamente differente da quella osservata nei segmenti intermedi e nel corpo intero (Fig 17B).
Fugura 17: attività ChE (media ±ES; n=5) espressa come nmol/min/mg proteine (A: ATChI-ChE, 470 μM, B: PTChI-ChE, 1880 μM) in differenti segmenti corporei (A: apicale; I: intermedio; P: posteriore; INTERO: corpo intero). Lettere diverse indicano differenze significative (p<0.05), one-way ANOVA (test di Tukey).
35
Con il substrato BTChI 1880 μM è stata osservata una bassa attività (BTChI-ChE) in tutti i segmenti e nel corpo intero, con un valore massimo di 2.6 ± 0.08 nmol/min/mg proteine nel segmento posteriore.
Dato che i segmenti posteriori hanno mostrato la più alta attività enzimatica, questi sono stati usati nei successivi esperimenti di caratterizzazione dei parametri cinetici. Inoltre, poiché non sono emerse differenze di attività statisticamente significative tra il segmento posteriore e quello intermedio, quest’ultimo è stato usato per gli esperimenti di inibizione delle colinesterasi.
Mediante un’analisi di regressione non lineare sono state ottenute le curve di attività colinesterasica con i tre substrati; con queste sono stati poi determinati i principali parametri cinetici. Le curve di attività ATChI-ChE e PTChI-ChE sono associate ad un R2 rispettivamente di 0.90 e 0.92, mentre la curva BTChI-ChE è associata ad un R2 di 0.78 (Fig. 18)
L’attività enzimatica più alta è stata riscontrata con il substrato ATChI 470 μM, con il quale è stato ottenuto un valore di 117.7 ± 1.7. Con il substrato PTChI 1880 μM è stata misurata un’attività di 64.1 ± 3.3. Con il substrato BTChI 1880 μM è stato osservato un valore di 2.6 ± 0.08. Tutti i valori sono espressi come nmol/min/mg proteine e rappresentano media ± ES (n=5).
Figura 18: regressione non lineare dell’attività colinesterasica in D. neapolitana (segmenti posteriori) con i substrati ATChI, PTChI, BTChI (range 29-3770 μM). Ogni punto rappresenta media ±ES (n=5).
36
I principali parametri cinetici (Tabella 1) hanno rivelato che la velocità massima di reazione (Vmax)
registrata per ATChI-ChE è 1.5 volte maggiore rispetto a quella osservata per PTChI-ChE, e che l’affinità di substrato (Km e Vmax /Km) per ATChI è maggiore di quella per PTChI. Per quanto
riguarda la reazione BTChI-ChE, sono stati riscontrati bassi valori sia di Vmax che di Km. Per tutti i
substrati utilizzati non è stata osservata una inibizione da substrato (Figura 18).
Dato che la costante di Michaelis-Menten Km rappresenta la concentrazione di substrato a cui la
velocità di reazione è la metà di Vmax, per i successivi esperimenti di inibizione di attività
enzimatica è stata scelta la concentrazione di substrato che più si avvicinava al doppio della Km
osservata. Quindi, le concentrazioni scelte per ATChI e PTChI sono state rispettivamente 470 μM e 1880 μM. L’attività BTChI-ChE non è stata ulteriormente considerata nello studio a causa della bassa attività enzimatica e della bassa affinità di substrato mostrate. Utilizzando inibitori modello è stato osservato che solo eserina emisolfato (inibitore generico di ChE) causa un’inibizione superiore al 70% rispetto al controllo a partire dalla concentrazione 1 μM, con una curva di regressione non lineare simile sia per ATChI-ChE che per PTChI-ChE (Figura 19).
A seguito di inibizione con BW284C51 (inibitore specifico per ACHE), alle maggiori concentrazioni testate, 800, 400 e 200 μM, l’attività ATChI-ChE è risultata essere significativamente differente dal controllo (p<0.001), mostrando un’inibizione del 40% circa. Invece, le concentrazioni di 100 e 1 μM non hanno prodotto nessun effetto inibitorio statisticamente significativo (Figura 20).
ATChI
PTChI
BTChI
Massima attività enzimatica
107.7±1.7
64.1±3.3
2.6±0.08
V
max112.5±4.5
78.4±3.5
2.8±0.1
K
m189.4±29.1
625.4±80.6
123.7±17.1
V
max/K
m0,59
0,12
0,02
R
20,90
0,92
0,78
Tabella 1: parametri cinetici di attività ChE in D. neapolitana (segmento posteriore) con ATChI, PTChI, BTChI come substrati (range 29-3770 μM). Ogni punto rappresenta media ± ES (n=5). Massima attività enzimatica e Vmax sono espressi come nmol/min/mg proteine; Km è espresso
37
Con l’inibitore iso-OMPA (specifico per BChE) non sono stati osservati effetti inibitori con tutti i substrati utilizzati, neppure alla massima concentrazione testata (10 mM).
Tramite uno studio di elettroforesi nativa sono state separate le proteine delle frazioni S9 ottenute dal corpo intero di D. neapolitana, assieme ad AChE purificata da anguilla elettrica (Electrophorus
electricus) e BChE purificata da siero equino utilizzati come standard (Figura 21).
Dall’osservazione diretta dei gel è emerso che BChE purificata idrolizza fortemente il substrato BTChI (Figura 21, lane 1), mentre non è stata osservata alcuna banda reattiva BTChI-ChE dove era stata caricata la frazione S9 di D. neapolitana (Figura 21, lane 2). AChE purificata ha mostrato una marcata banda reattiva dovuta all’idrolisi del substrato ATChI (Figura 21, lane 3), mentre lo stesso enzima preincubato con eserina emisolfato ha mostrato una banda reattiva fortemente inibita (Figura 21, lane 4). La frazione S9 di D. neapolitana incubata con ATChI ha mostrato una banda reattiva principale di circa 173 kDa ed una banda reattiva secondaria meno marcata di circa 69 kDa (Figura 21, lane 5). Nel caso della preincubazione della stessa frazione cellulare con eserina emisolfato, la banda reattiva principale è risultata parzialmente inibita e la banda reattiva secondaria è risultata totalmente inibita (Figura 21, lane 6). Incubando la frazione S9 con PTChI è stato osservato un risultato simile a quello ottenuto con ATChI, con la differenza che la banda reattiva
Figura 19: effetto di eserina emisolfato (range 0.001-10 μM) su attività ChE (ATChI 470 μM, PTChI 1880 μM) in D. neapolitana (segmento intermedio). Dati espressi come % di inibizione attività ChE. I valori di controllo (media ± ES) erano 108.4 ± 4.8 e 64.1 ± 4.6 nmol/min/mg proteine per ATChI e PTChI, rispettivamente. Valori percentuali ottenuti dall’attività media, n=5.
Figura 20: effetto di BW284C51 su attività ChE (ATChI 470 μM) in D. neapolitana (segmento intermedio). Dati espressi come % di inibizione attività ChE. Il valore di controllo (media ± ES) era 103.8 ± 2.3 nmol/min/mg proteine. Valori percentuali ottenuti dall’attività media, n=5. *significativamente differente dal controllo, p<0.001 (one-way ANOVA, TEST Di Dunnett).
38 Figura 21: elettroforesi nativa su gel di poliacrilammide. Colorazione per attività ChE linee 1-8, colorazione per attività CE linee 9 e 10. BChE purificata, BTChI (lane 1); S9 di D. neapolitana con BTChI (lane 2); AChE purificata, ATChI (lane 3); AChE purificata, preincubazione 30 minuti in eserina 1 μM (lane 4); S9 di D. neapolitana con ATChI (lane 5); S9 di D. neapolitana, preincubazione 30 minuti in eserina 1 μM, ATChI; S9 di D. neapolitana con PTChI (lane 7); S9 di D. neapolitana, preincubazione 30 minuti in eserina 1 μM, PTChI (lane 8); S9 di D.
neapolitana, 1- e 2-naftilacetato (lane 9); S9 di D. neapolitana, preincubazione 30 minuti in
eserina 1 μM, 1- e 2-naftilacetato (lane 10). Linee 1,3 e 4 caricate con 1U di AChE o BChE. Tutte le altre linee caricate con 50 μg di proteine.
principale era di circa 150 kDa e quella secondaria di circa 52 kDa (Figura 21, linea 7). Anche in questo caso, la preincubazione con eserina emisolfato ha inibito parzialmente la banda reattiva principale e totalmente quella secondaria (Figura 21, linea 8). L’elettroforesi nativa per l’identificazione di carbossilesterasi (CE) nelle frazioni S9 di D. neapolitana (corpo intero) ha mostrato la presenza di tre principali regioni con attività carbossilesterasica usando 1-naftilacetato e 2-naftilacetato come substrati (Figura 21, lane 9). Queste bande reattive hanno mostrato pesi molecolari di 173, 35 e 25 kDa, rispettivamente; inoltre, nella zona corrispondente a 25 kDa sono state osservate due bande distinte. Nella lane che era stata preincubata con eserina emisolfato, nessuna delle bande ad attività carbossilesterasica ha mostrato inibizione (Figura 21, linea 10).
A seguito dei test di inibizione in vitro delle attività ATChI-ChE e PTChI-ChE con carbammati quali Carbofurano, Methomyl, Aldicarb e Carbaryl, sono stati ottenuti dei valori di IC50
(concentrazione alla quale si osserva un effetto inibitorio del 50%). Questi valori, espressi come μM, hanno mostrato che le attività di entrambi gli enzimi sono state inibite dai carbammati testati, ad eccezione di Carbaryl che ha mostrato un effetto inibitorio meno marcato, in modo paragonabile
39
a quanto osservato con l’inibitore modello eserina emisolfato. L’attività PTChI-ChE è stata inibita maggiormente rispetto a ATChI-ChE (Tabella 2) utilizzando gli stessi carbammati.
ATChI-ChE
IC50
IC50 L.C. 95%
R
2Eserina
0,54
0.10-2.69
0,98
Carbofurano
0,56
0.42-0.73
0,99
Methomyl
0,31
0.27-0.35
0,99
Aldicarb
0,22
0.15-0.32
0,98
Carbaryl
4,93
3.05-7.99
0,97
PTChI-ChE
IC
50IC
50L.C. 95%
R
2Eserina
0,20
0.02-1.90
0,97
Carbofurano
0,27
0.19-0.36
0,98
Methomyl
0,23
0.18-0.31
0,99
Aldicarb
0,11
0.08-0.13
0,99
Carbaryl
3,12
2.02-4.77
0,97
Tabella 2: effetto inibitorio su attività ATChI-ChE e PTChI-ChE di eserina emisolfato e quattro carbammati. Valori espressi come IC50 (μM); limiti di confidenza 95%
40
5.
DISCUSSIONI
In questo studio sono state caratterizzate le colinesterasi solubili di D. neapolitana allo scopo di indagare il loro possibile impiego come biomarker di esposizione in questa specie. Sebbene le ChE siano biomarker largamente utilizzati in ecotossicologia, sia in invertebrati che vertebrati, la totale assenza di informazioni in D. neapolitana ha guidato la scelta dell’argomento di questo lavoro di tesi. La necessità di effettuare una caratterizzazione biochimica in vitro dell’enzima deriva dall’esigenza di stabilire i principali caratteri cinetici, l’affinità a differenti substrati e la sensibilità ad inibitori modello prima di un possibile impiego in condizioni di campo. Infatti misurare l’attività ChE in una specie senza disporre di una sua caratterizzazione biochimica può portare a una valutazione errata dei risultati. Come indicato da Gomes et al. (2014), la caratterizzazione delle colinesterasi rappresenta una questione chiave, dato che nei tessuti possono essere presenti diversi tipi di esterasi aspecifiche che possono confondere l’interpretazione dell’attività enzimatica misurata. In effetti i substrati modello ATChI, PTChI e BTChI possono essere idrolizzati da differenti forme di esterasi (Ferreira et al., 2010; Howcroft et al., 2011). Inoltre differenti ChE possono presentare una diversa sensibilità a contaminanti anti-ChE. Questo può introdurre errori nella valutazione ecotossicologica degli effetti di tali contaminanti (Howcroft et al., 2011).
In D. neapolitana l’attività ChE in differenti segmenti corporei (apicale, intermedio, posteriore) è stata comparata ai livelli di attività misurati nel verme in toto. Sulla base dei risultati ottenuti, il tasso di idrolisi più alto è stato osservato nei segmenti posteriori con entrambi i substrati ATChI e PTChI. Con ATChI i segmenti posteriori hanno mostrato differenze significative sia rispetto ai segmenti apicali che al verme intero. Questo risultato sembra essere in contrasto con quello osservato in H. diversicolor da Scaps et al. (1996), dove il valore più alto di attività ATChI-ChE è stato rilevato nei segmenti apicali. Può essere ipotizzato che, in regioni corporee rigenerate, la presenza di tessuti metabolicamente molto attivi (incluso il tessuto nervoso) e la presenza di grandi quantità di riserve energetiche possano alterare l’attività enzimatica. In effetti nelle porzioni corporee rigenerate del polichete Eurytoe complanata sono stati osservati alti livelli di trigliceridi e di lipidi totali (Yàñez-Rivera and Méndez, 2014).
In relazione alle colinesterasi, tra gli invertebrati si possono comunemente osservare diversi livelli di affinità di substrato. Ad esempio, le ChE di mitili ed ostriche idrolizzano preferenzialmente ATChI (Valbonesi et at., 2003), mentre le ChE del bivalve Corbicula fluminea hanno una maggiore affinità per PTChI (Mora et al., 1999).
41
Per quanto riguarda il phylum Annelida, è stata riscontrata una maggiore affinità di substrato per PTChI negli oligocheti Eisenia fetida (Scaps et al., 1996), Eisenia andrei (Caselli et al., 2006) ed
Enchytraeus albidus (Howcroft et al., 2011). Differentemente, è stata osservata una maggiore
affinità di substrato per ATChI nelle specie Lumbriculus terrestris (Rault et al., 2007), Lumbriculus
castaneus (Rault et al., 2007) e Lumbriculus variegatus (Kristoff et al., 2006). Inoltre può essere
importante notare che le ChE di L. variegatus hanno mostrato un alto livello di attività enzimatica (266 ± 2 nmol/min/mg proteine) con il substrato BTChI; questo suggerisce la presenza di una isoforma BChE attiva. E’ da sottolineare che le ChE di policheti sono state caratterizzate in pochissime specie, come osservabile in tabella 3 dove sono indicati i dati biochimici ed i parametri cinetici disponibili in letteratura, assieme ai dati sperimentali di questo lavoro.
Da questo studio è emerso che le ChE di D. neapolitana idrolizzano preferenzialmente ATChI e secondariamente PTChI, mentre BTChI è stato scarsamente idrolizzato. Confrontando i dati sperimentali con quello osservato in altre specie di policheti, le ChE di D. neapolitana idrolizzano ATChI 2.7 volte meno di quelle di C. teleta e 363 volte meno di quelle di A. marina. Deve essere comunque notato che l’alta attività enzimatica misurata in A. marina è stata osservata utilizzando entrambi i substrati a concentrazioni nel range mM. In questo studio, in quello di Gomes et al. (2014) e in quello di Scaps et al. (1996), le concentrazioni di substrati utilizzate erano nel range
Tabella 3: confronto dei valori di attività ChE e dei parametri cinetici sulla base di questo lavoro e degli studi presenti in letteratura. a: questo lavoro; b: Capitella teleta (Gomes et al., 2014); c: Arenicola marina (Hannam et al., 2008); d: Hediste diversicolor (Scaps et al., 1996); e: (Scaps e Borot, 2000); f: (Solè et al., 2009); g: (Buffet et al., 2011). Attività enzimatica e Vmax sono espressi in nmol/min/mg proteina; Km è espressa in µM.
D. neapolitanaa C. teletab A. marinac H. diversicolor
ATChI-ChE 107.7 296.9 39180 3.6d - (21.6-39.4)e - (5.8-199)f-71.3g BTChI-ChE 2.6 15.1 n.d. 0.3d PTChI-ChE 64.1 31.1 59370 1.7d ATChI-ChE Vmax 112.5 366.9 ATChI-ChE Km 189.4 190 ATChI-ChE Vmax/Km 0.59 1.9 BTChI-ChE Vmax 2.8 16.7 BTChI-ChE Km 123.7 10 BTChI-ChE Vmax/Km 0.02 1.6 PTChI-ChE Vmax 78.4 37.8 PTChI-ChE Km 625.4 50 PTChI-ChE Vmax/Km 0.12 0.76
42
µM. I valori di attività ATChI-ChE riportati per H. diversicolor variano ampiamente da 3.6 nmol/min/mg proteine (Scaps et al., 1996) a 199 nmol/min/mg proteine (Solé et al., 2009).
Complessivamente i dati di questo studio e di quelli presenti in letteratura indicano che nel gruppo dei policheti esistono ampie variazioni nei livelli basali di attività colinesterasica.
Sebbene l’obiettivo di questo lavoro sia quello di contribuire alla conoscenza dei livelli basali e dei parametri cinetici di attività ChE in D. neapolitana, anche mediante una caratterizzazione in vitro degli effetti di inibitori modello, deve essere sottolineato che molti contaminanti possono potenzialmente interagire con il sito attivo delle colinesterasi. È stato dimostrato che l’attività idrolitica di AChE è fortemente dipendente dall’ambiente elettrostatico nel quale ha luogo la reazione (Malany et al., 1999). Nonostante questo enzima sia caratterizzato da una capacità catalitica molto alta, vicina al limite di diffusione del substrato e dei prodotti, il sito attivo è nascosto nel core della molecola, in una tasca catalitica stretta e profonda. La presenza del dipolo elettrico presente lungo questa tasca permette ad una molecola cationica come l’acetilcolina di venire facilitata nel suo movimento all’interno del sito attivo (Massouliè et al., 2008). È stato ipotizzato che interazioni ioniche con sostanze cariche presenti in ambiente (come alcune tipologie di contaminanti) possano modulare l’attività di AChE (Nunes, 2011). Questo evidenzia la necessità di caratterizzare i livelli enzimatici basali in organismi distribuiti in aree differenti e di studiare gli effetti di esposizioni in vivo ed in vitro a potenziali inibitori delle ChE, come surfactanti, detergenti, metalli e miscele complesse.
Nell’ambito dei policheti le uniche informazioni disponibili per effettuare analisi comparative dei parametri cinetici di D. neapolitana sono quelle relative a C. teleta, nello studio di Gomes et al. (2014). Da questo confronto è emerso che, utilizzando il substrato ATChI, i valori di Km sono molto
simili tra le due specie, ma in C. teleta si osserva una Vmax 3.2 volte superiore e un rapporto
Vmax/Km superiore; ciò indica che le ChE di C. teleta presentano una maggiore affinità di substrato.
In D. neapolitana, con il substrato BTChI, è stato registrato un tasso di idrolisi estremamente basso (poche nanomoli/min/mg proteina) e con un andamento non lineare della cinetica di reazione, a differenza di quanto osservato con gli altri substrati utilizzati. Inoltre l’assenza di inibizione ad opera di iso-OMPA (inibitore specifico di BChE) ad alte concentrazioni (10 mM) può essere interpretata come mancanza di una forma di butirrilcolinesterasi attiva in questa specie. I bassi valori di attività registrati possono essere dovuti alla presenza di altre esterasi aspecifiche, comunque capaci di idrolizzare ridotte quantità di substrato. Questa ipotesi è supportata dai risultati dell’analisi elettroforetica in condizioni native, a seguito della quale non sono state visualizzate bande reattive ad attività BChE ma sono state osservate bande ad attività carbossilesterasica (CE).
43
Un ulteriore supporto a questa ipotesi può essere costituito dai risultati dello studio di Talesa et al. (1997), dove una forma purificata di AChE legata alla membrana di Spirographis spallanzani non ha mostrato attività con BTChI. Tuttavia, sulla base di studi disponibili su roditori e uomo (Mack e Robitzki, 2000), non può essere escluso un ruolo funzionale di BChE nei processi regolatori della proliferazione cellulare e dell’inizio del differenziamento durante le fasi precoci di sviluppo neurale, indipendentemente dalla sua attività enzimatica.
L’attività enzimatica PTChI-ChE osservata in D. neapolitana è circa due volte superiore a quella osservata in C. teleta, anche se il valore di Km indica una affinità di substrato minore. La
visualizzazione di bande reattive con mobilità elettroforetica diversa rispetto a quelle osservate per ATChI (173 e 79 kDa per ATChI, 150 e 52 kDa per PTChI) può indicare la presenza di due differenti isoforme enzimatiche capaci di idrolizzare ciascuno dei due diversi substrati. Rimane comunque necessario svolgere ulteriori indagini per stabilire se le bande secondarie corrispondono a prodotti di degradazione o se rappresentano altre esterasi.
Riguardo all’attività ATChI-ChE su gel elettroforetico, la presenza di una banda reattiva principale ad alto peso molecolare è in accordo con quanto osservato nell’oligochete L. variegatus da Kristoff et al. (2006).
Per caratterizzare gli effetti inibitori in vitro sull’attività ChE di D. neapolitana sono stati utilizzati gli inibitori modello eserina emisolfato (aspecifico per ChE), BW284C51 (specifico per AChE) ed iso-OMPA (specifico per BChE). Sebbene eserina sia l’inibitore AChE noto da più tempo (Augustinsson, 1961), non tutti gli invertebrati presentano ChE sensibili a tale inibitore, come dimostrato nell’oligochete Eisenia fetida (Øien and Stenersen, 1984). Differentemente, in D.
neapolitana entrambe le attività ATChI-ChE e PTChI-ChE sono risultate essere sensibili ad eserina,
mostrando un andamento dose-dipendente e una inibizione del 70-80% rispetto al controllo, alla concentrazione 1 µM. Questi risultati sono in accordo con quelli ottenuti in C. teleta (Gomes et al.,
2014) ed in Eisenia andrei (Caselli et al., 2006). L’effetto inibitorio di eserina 1 µM è stato
evidenziato anche su gel elettroforetico in condizioni native, sul quale è stata osservata inibizione parziale della banda reattiva principale ed inibizione totale della banda secondaria.
Le frazioni S9 su cui sono state svolte le analisi sono state ottenute da tessuti omogeneizzati senza l’utilizzo di detergenti, come descritto in lavori su altri policheti, quali Capitella teleta (Gomes et al., 2014), Arenicola marina (Hannam et al., 2008) ed Hediste diversicolor (Scaps et al., 1996). Tali frazioni S9 sono scarsamente purificate rispetto, ad esempio, a microsomi o ad altre frazioni cellulari estratte tramite l’uso di detergenti, quindi possono essere presenti varie altre forme di
44
esterasi aspecifiche capaci di idrolizzare entrambi i substrati. Tuttavia, l’alta sensibilità ad eserina potrebbe suggerire che, nei tessuti di D. neapolitana, le esterasi aspecifiche sono meno rappresentate delle ChE.
L’inibitore BW284C51 ha mostrato effetti in vitro sull’attività ATChI-ChE di D. neapolitana solo ad alte concentrazioni, causando inibizione del 40% alle concentrazioni 800, 400 e 200 µM. Similmente, in due specie di molluschi gasteropodi BW284C51 1000 µM ha causato una inibizione di attività ATChI-ChE del 30-40% (Gagnaire et al., 2008). Differentemente, in C. teleta (Gomes et al, 2014) la concentrazione 1 µM è stata sufficiente ad inibire totalmente la stessa attività enzimatica. Nel polichete Spirographis spallanzani (Talesa et al., 1997), BW284C51 100 µM ha causato inibizione totale di attività ATChI-ChE. Inoltre deve essere osservato che l’attività ATChI- ChE in D. neapolitana non è risultata essere inibita da un eccesso di substrato, come è stato osservato anche in molluschi gasteropodi da Gagnaire et al. (2008). Questi risultati possono indicare che, nonostante possa essere presente una forma di AChE, la coesistenza di altre esterasi potrebbe contribuire all’attività enzimatica a causa di una loro partecipazione all’idrolisi del substrato, portando anche a differenti risposte all’inibitore specifico BW284C51. Pertanto, l’attività enzimatica misurata in D. neapolitana è probabilmente dovuta in gran parte ad AChE e, in misura minore, ad altre esterasi.
Come riportato da Bebianno et al. (2004), nella maggior parte delle specie le ChE e le CE (esterasi