6. MATERIALI E METOD
6.4 Analisi Total Oxyradical Scavenging Capacity assay (TOSCA)
Ogni campione è stato omogenato manualmente con Potter da 5 ml, in vetro, dalla forma cilindrica e con pistoni in Teflon (Figura 6.5), in rapporto 1 g di tessuto / 4 ml di soluzione tampone, costituita da: tampone fosfato di potassio 50 mM a ph 7,5; inibitori di proteasi (Protease Inhibitor Cocktail Tablets; Complete Mini-Roche Diagnostics, USA) a concentrazione 1 x e NaCl 1,8%.
L’ omogenato ottenuto è stato sottoposto a ultracentrifugazione secondo il seguente protocollo:
I centrifuga - 25 min a 13,500 x g, che consente il recupero di surnatante, comprendente frazione citosolica + frazione microsomiale;
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II centrifuga - 1h:46 min a 100,000 x g, che consente il recupero di surnatante, comprendente la sola frazione citosolica.
La frazione citosolica è stata aliquotata in eppendorf e stoccata a -80°C per le successive analisi TOSCA.
La tecnica TOSCA (Total Oxyradical Scavenging Capacity Assay), permette un’analisi diretta dell’attività scavenger dei campioni ottenuti, verso i radicali liberi (Regoli & Winston, 1999). Il saggio è basato sulla reazione tra le varie specie radicaliche, perossilici (ROO·), idrossilici (·OH) e derivati del perossinitrito (ONOO·), generate artificialmente, a regime costante (35°C), con l’acido α-cheto-γ-metiolbutirrico (KMBA); il quale in presenza di radicali si ossida e produce etilene. L'etile formatosi viene dosato mediante gascromatografia.
Radicali + KMBA = Etilene
Sulla base dell’etilene prodotto, viene calcolata la capacità antiossidante del campione, a confronto con una reazione di controllo: l’antiossidante presente nel campione compete con il KMBA nella reazione con i radicali liberi, quindi la produzione di etilene risulterà minore rispetto alla reazione di controllo, in cui non sono presenti molecole antiossidanti.
Etilene Campione (Antiossidante) << Etilene Controllo
Per i tre diversi sistemi di generazione dei radicali dell’ossigeno, sono necessarie adeguate condizioni di saggio:
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radicali perossilici sono stati generati dall’omolisi termica di 20 mM di 2,2´-azo- bis-ammidinopropano (ABAP) a 35°C, in 100 mM di soluzione tampone di fosfato di potassio, a pH 7,4.
radicali idrossilici sono stati generati a 35°C, secondo la reazione di Fenton modificata, contenente 1,8 µM di Fe3+, 3,6 µM di EDTA e 1,8 µM di acido ascorbico, in 100 mM di soluzione tampone di fosfato di potassio a pH 7,4.
radicali di derivazione del perossinitrito, sono stati generati a 35°C a partire dalla decomposizione del SIN-1 (3-morfolinosidnonimine N-etilcarbammide) in un tampone fosfato di potassio 100 mM (pH 7,4) con 0,1 mM di DTPA (acido dietilene-triamina-pentaacetico).
Le reazioni con KMBA 0,2 mM, sono state effettuate in vials di volume 10 ml sigillati con valvole a tenuta di gas costante Mininert® (Supelco, Bellefonte, PA,USA), in un volume finale di 1 ml. (Figura 6.6)
Figura 6.6: Vials con valvole a tenuta di gas costante.
L’etilene prodotto all’interno di ciascun contenitore, è stato prelevato (aliquota di 200 microlitri) dallo spazio di testa dei vials a intervalli regolari durante tutto il corso della reazione. La produzione di etilene è stata effettuata mediante gascromatografo
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(Agilent) Hewlett-Packard (HP 7820A Series, Andover, MA, USA), dotato di colonna
Supelco DB-1 capillare (30 x 0,32 x 0,25 millimetri) e
un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). Le temperature del forno,
dell'iniettore e del FID eran, rispettivamente 35,160 e 220°C. Come gas di trasporto è stato utilizzato l’idrogeno (velocità di flusso di 1 ml/min) con rapporto di divisione 20:1. Il software OpenLAB utilizzato, ha permesso di calcolare la produzione di etilene totale, per ciascun campione, in valori TOSCA.
I valori TOSCA sono stati calcolati secondo l’equazione: TOSCA= 100 - ( ∫SA / ∫CA * 100 )
dove ∫SA e ∫CA rappresentano gli integrali delle aree sottese alla curva cinetica, prodotta dal software, ottenuta rispettivamente nella reazione dopo l’aggiunta del campione e nella reazione di controllo.
Un valore TOSCA = 0, corrisponde ad un campione senza capacità scavenger, cioè nessuna inibizione della formazione di etilene, rispetto alla reazione di controllo, dove ∫SA / ∫CA = 1, e valori maggiori di TOSCA indicano maggiore capacità scavenger.
69
6.5 Analisi statistica
I dati sono stati espressi come medie ± dev. Standard
L’analisi statistica dei dati ottenuti con la metodica TOSCA è stata eseguita tramite il test t di Student, per dati non appaiati.
La significatività statistica è stata fissata a p<0.05. L’analisi è stata condotta con il software Prism 4.0 (GraphPad Software Inc. San Diego CA).
70
7. RISULTATI
In Figura 7.1. vengono riportati i valori TOSCA medi totali. Si osserva che i ratti allenati mostrano valori TOSCA medi superiori rispetto ai sedentari (1,89±0,18 Vs 1,66±0,20 TOSCA units/µL p<0.01).
71
Andando ad analizzare i dati nello specifico, come dimostrato in Figura 7.2, si osserva che i ratti allenati (in azzurro) mostrano un'attività scavenger superiore rispetto ai sedentari (in rosso) nei confronti dei radicali perossilici (1,57±0,32vs 1,13±0,14 TOSCA units/µL p<0,01 ); idrossilici (2,11±0,2 vs 1,93±0,2 TOSCA units/µL p<0,01)e derivati della perossinitrite (1,99±0,18 vs 1,65±0,13 TOSCA units/µL p<0,01).
Figura 7.2. Valori TOSCA atleti vs sedentari nei confronti dei radicali perossilici, idrossilici e derivati della perossinitrite. P<0,01
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8. DISCUSSIONE
Il nostro studio ha dimostrato come una regolare attività fisica è in grado di determinare un miglioramento della capacità antiossdante a livello ippocampale. Tale effetto è evidente sia verso i radicali perossilici e derivati della perossinitrite che sono causa della perossidazione lipidica, ma anche verso i radicali idrossilici che rappresentano la specie radicalica più dannosa per i componenti cellulari.
Tuttavia in letteratura esistono molte evidenze scientifiche contrastanti tra loro [97]//[98].
Tali differenze sono talvolta da ricercarsi nelle metodiche differenti utilizzate per la valutazione dello stress ossidativo.
Di solito, la misura diretta della produzione di radicali liberi e delle specie reattive è molto difficile da eseguire, data l’alta reattività dei radicali e la loro bassa concentrazione allo stato stazionario. Per questo il “golden standard” per la valutazione dello stress ossidativo è la spettroscopia di risonanza di spin dell’elettrone (ESR) tecnica che però richiede una strumentazione molto costosa ed è complicata da eseguire.
Quindi per la valutazione dello stress ossidativo vengono usati dei biomarkers, come ad esempio la misurazione di sottoprodotti di stress ossidativo come l’acido reattivo tiobarbiturico (TBARS) prodotto dalla perossidazione lipidica, o la malondialdeide (MDA), oppure andando a dosare qualche effetto dei radicali liberi sulle molecole.
Questi metodi presentano un alto grado di variabilità, che rende quindi difficile comparare la capacità dei diversi antiossidanti [99].
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La tecnica di analisi TOSCA, usata per questo studio, consente un’analisi quantitativa e qualitativa delle varie specie radicaliche. Infatti permette di quantificare in unità TOSCA (ml di liquido oppure gr di tessuto della sostanza antiossidante) la capacità antiradicalica della sostanza in esame e di valutarne la capacità antiossidante di una sostanza nei confronti delle varie specie radicaliche (perossilici, idrossilici, derivati della perossinitrite).
Dal nostro studio possiamo concludere che se da un lato l’attività fisica, come ormai conclamato dalla letteratura, induce un aumento delle specie radicaliche, dall’altro questo aumento determina un fenomeno di adattamento tramite il quale vengono stimolati i sistemi scavenger tale per cui a livello ippocampale si osserva l’aumento della capacità antiossidante. Il risultato ottenuto nel nostro studio è altamente significativo, dato che a livello cerebrale i sistemi scavenger risultano essere meno attivi ed efficaci che in altri distretti corporei.
Questo effetto antiossidante dell’esercizio fisico potrebbe indurre un rallentamento dei processi di invecchiamento cellulare e quindi prevenire le patologie e i tumori per le quali lo sbilanciamento tra la produzione di radicali liberi e i sistemi scavenger rappresenta un fattore scatenante.
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