Duodeno e colon di gatto sono stati prelevati, congelati in azoto liquido e conservati a - 80°C fino al processamento. Come controllo positivo è stato utilizzato l’intestino di topo (dato non mostrato). 50 mg di tessuto sono stati omogenizzati in 500 μl di buffer SDS (Tris–HCl, 62.5 mM; pH 6.8; SDS, 2%; and glycerol, 20%) arricchito con un cocktail di inibitori di proteasi (Sigma-Aldrich, Co, St. Louis, MO, USA). Il contenuto proteico totale è stato calcolato tramite kit tramite il metodo di Peterson (modifica della curca di Lowry). Aliquote da 20 μg di proteina totale sono state separate su Bolt 4–12% bis-Tris Plus (Life Technologies Ltd, Paisley, UK) per 45 minuti a 165 V. le proteine sono state poi trasferite tramite elettroforesi su una membrana di nitrocellulosa con un sistema semi-
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asciutto (Trans Turbo Blot Bio-Rad). Legami aspecifici sulla membrana di nitrocellulosa sono stati bloccati con latte in polvere al 5% in PBS-T20 (Phosphate Buffer Saline-0.1% Tween-20) per un’ora a temperatura ambiente. Dopo il blocco, le membrane sono state incubate a 4°C con gli anticorpi primari della tabella 1 diluiti in Tris-buffered saline-T20 (TBS-T20 20 mM Tris–HCl, pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.1% T-20). Dopo i lavaggi, le membrane sono state incubate con anticorpo goat anti rabbit biotina coniugato (diluizione 1:50000 in TBS-T20, 1 h at RT) e con anticorpo anti-biotina horseradish peroxidase (HRP)-linked (diluizione 1:1000) per 40 minuti a temperatura ambiente. Le bande immunoreattive sono state visualizzate tramite substrato chemoluminescente (Clarity Western ECL Substrate Bio Radsulla base delle istruzioni fornite dalla ditta. L’intensità del segnale è stata acquisita tramite Chemidoc Instrument e il peso molecolare della banda risultante è stato analizzato Quantity One Software (Bio-Rad). L’analisi di WB su colon di gatto ha mostrato una banda di 38 kDa (teoricamente il peso molecolare del GPR55 felino). Il WB è stato eseguito anche per il recettore TRPA1 e 5-HT1a ottenendo le bande al peso molecolare desiderato, pertanto si suppone che questi anticorpi considerati siano specifici (Figura 15).
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Figura 15: WB su colon di
gatto per dimostrare la specificità degli anticorpi. A) GPR55 B) TRPA1 C) 5-HT1a
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4 Risultati
4.1 CB1R
Sono presenti differenti tipologie cellulari immunoreattive (-IR) al CB1R nella mucosa, come ad esempio le cellule della mucosa gastrica (Figura 16 a-c), le cellule EECs (Figura 16 d-f), cellule EECs CCK-IR e cellule globet (Figura 16 g-l), mastociti (MCs) triptasi-IR della lamina propria (Figura 17 a-c). Si osserva anche CB1R-IR debole a livello della muscolatura liscia della tunica muscolaris. In particolare le cellule goblet, riconoscibili per la loro forma e per la presenza di nuclei confinati nella parte profonda della cellula, mostrano reattività al CB1R molto evidente a livello della membrana, ma risulta totalmente assente nel citoplasma. Negli altri tipi cellulari la marcatura è altamente diffusa nel citoplasma mentre quella sulla membrana è meno apprezzabile. Degno di nota è il fatto che, sebbene i due anticorpi che abbiamo utilizzato diretti contro il CB1R siano diretti verso due epitopi contigui del CB1R umano (411-462 Byorbit; 461-472 Abcam), le EECs vengono marcate solo dal CB1R della Byorbit, mentre le MCs solo con il CB1R Abcam. Si osserva anche CB1R-IR debole dei neuroni del plesso mienterico (Figura 17
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Figura 16: immagini di immunofluorenscenza su criosezioni del tGI di gatto,
marcatura per il CB1R. a-c) le frecce indicano elementi -IR nella mucosa pilorica; d-f) Le frecce indicano cellule enteroendocrine del piloro; g-l) le frecce indicano cellule caliciformi della mucosa dell’intestino tenue; (g-i) cellule caliciformi dell'intestino crasso; (j-l) cellule caliciformi che esprimo forte marcatura a livello di membrana citoplasmatica.
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Figura 17: immagini di immunofluorenscenza su criosezioni del tGI di gatto, marcatura
per il CB1R. Nuclei messi in evidenza con marcatore DAPI. a-c) Le frecce indicano mastociti della lamina propria triptasi- CB1R-positivi (a) e CB1R positivi (b); (c) merge; d-f) neuroni del plesso mienterico lievemente positivi al CB1R.
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4.2 CB2R
Le cellule enteroendocrine del tratto gastrico, gli enterociti e i macrofagi della lamina propria sono positivi al recettore CB2. Solo poche plasmacellule IgA-IR mostrano una debole sovrapposizione con il CB2R (dato non mostrato). A livello di piloro e intestino, le cellule enteroendocrine cromogranina- (Figura 18a a-c) e 5-HT-positive colocalizzano con il CB2R (Figura 18a d-f). Gli enterociti del piccolo e grande intestino mostrano evidente immunoreattività al CB2R, ma la distribuzione epiteliale lungo il tGI risulta non seguire un pattern ed essere molto diversa nelle specie che abbiamo preso in esame (Galiazzo G et al., 2018). Nel piccolo intestino del soggetto #2 una marcatura molto evidente è espressa a livello della superficie degli enterociti della parte più interna dei villi e nella parte intermedia (Figura 18a g, h). A livello del colon le cellule CB2R positive sono evidenti nelle cellule epiteliali della porzione interna delle cripte (Figura
18a i). Solo le cellule goblet del grande intestino sono positive (Figura 18a i). Le cellule
enteroendocrine del grande intestino, in particolare di ileo e colon, mostrano granulazione citoplasmatica positiva al CB2R (Figura 18b j, l). I macrofagi della lamina propria IBA1 positivi sono anche CB2R positivi (Figura 18b m-o). La muscolatura liscia è anch’essa CB2R-IR (dato non mostrato). La glia e i neuroni del Sistema Nervoso Enterico non sembrano essere positivi.
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Figura 18a: immagini di immunofluorenscenza su criosezioni del tGI di gatto,
marcatura per il CB2R. Nuclei messi in evidenza con marcatore DAPI. a,b) le frecce indicano cellule enteroendrocrine CB2R-IR; c) che coesprimono cromogranina-A (CGA); d, f) le frecce indicano cellule enteroendocrine CB2R- 5-HT positive; g, h) intestino tenue #2: CB2R-IR sulla superficie luminale degli enterociti distribuiti lungo la porzione apicale dei villi (frecce bianche), mentre nella metà basale le cellule epiteliali sono CB2R negative (frecce vuote); i) colon, CB2R-IR membrane cellulari delle cellule ghiandolari (frecce bianche) e caliciformi (frecce vuote).
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Figura 18b: immagini di immunofluorenscenza su criosezioni del tGI di gatto, marcatura
per il CB2R. Nuclei messi in evidenza con marcatore DAPI. j-l) le frecce indicano cellule enteroendocrine del colon positive al CB2R; m-o) macrofagi della lamina propria che coesprimono marcatura con CB2R (frecce)
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4.3 GPR55
L’immunoreattività al GPR55 è evidente principalmente a livello delle cellule epiteliali, delle cellule enteroendocrine, immunociti e neuroni enterici. In particolare si osserva positività con aspetto granulare nel citoplasma delle cellule enteroendocrine distribuite lungo il piloro, piccolo e grande intestino (Figura 19 a-c); nel grande intestino le cellule enteroendocrine risultano essere più grandi rispetto al piccolo intestino. Le cellule delle cripte del grande intestino mostrano un segnale positivo per il GPR55 nel citoplasma, debole e granulare (Figura 19 b, c). Gli immunociti della lamina propria e sopra la placca del Peyer risultano GPR55-IR (Figura 19 d, e). Non vi è colocalizzazione tra plasmacellullule IgA-IR e GPR55-IR a livello della lamina propria (Figura 19 f). Sia il plesso mienterico che sottomucoso sono lievemente positivi al GPR55 (Figura 19 g-i).
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Figura 19: immagini di immunofluorenscenza su criosezioni del tGI di gatto, marcatura
per il GPR55. Nuclei messi in evidenza con marcatore DAPI. a-c) le frecce indicano positività al GPR55 su cellule enteroendocrine di colon (b); d-e) noduli linfatici intestinali GPR55-IR. Le frecce indicano la muscolaris mucosae; f) le cellule della lamina propria IgA-IR non sono GPR55-IR; g-1) plesso mienterico con nuclei positivi (stelle bianche) al GPR55 Abbreviazioni: LMC: circular muscle layer, strato muscolare circolare; LML: longitudinal muscle layer, strato muscolare longitudinale.
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4.4 PPARα
Il PPARα è espresso principalmente dalle cellule parietali putative delle ghiandole piloriche (Figura 20 a-c), dagli immunociti intestinali (Figura 20 d, e), le cellule muscolari lisce (Figura 20 f) e, soprattutto, le cellule gliali enteriche (Figura 20 g-i). solo a livello dello stomaco le cellule gliali enteriche sono state osservate anche nella tunica muscolaris.
4.5 PPARγ
Il PPARγ è principalmente espresso nei nuclei dei neuroni del plesso mienterico (Figura
20 j-m). Inoltre, anche alcune cellule della lamina propria sono PPARγ-IR (dato non
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Figura 20: immagini di immunofluorenscenza su criosezioni del tGI di gatto,
marcatura per il PPARα (a-i) e PPARγ (j-l). I nuclei cellulari sono stati evidenziati con il marcatore nucleare DAPI. a-b) le frecce indicano tre ghiandole piloriche (probabilmente ghiandole parietali) che esprimono positività al PPARα; d-e) linfonodo intestinale con molti immunociti positivi al PPARα; f) cellule muscolari lisce dello strato muscolare longitudinale (LML) positive al PPARα; g-i) le stelle indicano il nucleo di alcuni neuroni del plesso mienterico. Le frecce indicano i nuclei di tre cellule gliali immunopositive al GFAP (anticorpo anti-proteina fibrillare acida della glia) (i) che co-esprimevano l'immunoreattività per il PPARα; j-l) Le stelle indicano i nuclei di alcuni neuroni del plesso mienterico, con debole positività per il PPARγ. Abbreviazioni: LMC: circular muscle layer, strato muscolare circolare; LML: longitudinal muscle layer, strato muscolare longitudinale.
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4.6 TRPA1
Sono stati osservati neuroni del plesso mienterico gastrico (Figura 21 a, b) e intestinale (Figura 21 c) e del plesso sottomucoso TRPA1-IR, ma la morfologia non è ancora stata investigata. Nella glia enterica è possibile anche osservare fasci di nervi TRPA1-IR. Nel piccolo e grande intestino, il TRPA1 è espresso dalle cellule goblet (Figura 21 d-f).
4.7 5-HT1aR
Apparentemente, tutte le membrane cellulari delle cellule epiteliali del tGI sono positive al recettore 5-HT1a (Figura 21 g-i). Anche la muscolatura liscia della tunica muscolaris, la muscolaris mucosae e i vasi sanguigni della sottomucosa sono positivi (dato non mostrato).