Ancoraggio di Molecole Sonda a Strutture Saccaridiche di Riconoscimento Molecolare

Lys-DTPA terbutilato e Lys-AAZTA terbutilato sono stati donati dai laboratori Bracco Imaging SpA.

D(+)-lattosio monoidrato, gadolinio cloruro, sodio cianoboroidruro, acetonitrile e metanolo sono stati acquistati da Sigma-Aldrich; acido acetico glaciale, acido trifluoroacetico e toluene sono stati forniti da Merk.

La purificazione è stata condotta sia con cromatografia ad esclusione dimensionale (resina Superdex, l= 92, ø= 2 cm) sia con tecnica HPLC. In questo caso si è usato un sistema HPLC-UV Merk-Hitachi equipaggiato con una pompa L-6200, un autocampionatore AS-2000A e un sistema a Diode Array Detector L-4500A. L’acquisizione e l’analisi dei dati sono state condotte con un D-7000 Chromatography Data Station software (Merck- Hitachi), utilizzando colonne semipreparative Luna NH2 100 A (Phoenomenex), 10 x 250 mm e Spherisorb phenyl semiprep (Waters), 10 x 250 mm.

Le analisi di spettrometria di massa electrospray sono state condotte con uno spettrometro di massa a trappola ionica (modello LCQ Deca XP Plus, Thermo-Finnigan. San Jose, CA, USA), nella modalità di ionizzazione positiva (+4.5 kV).

Le misure di risonanza magnetica nucleare sono state condotte con uno strumento JEOL ECX (400 MHz).

Lattit-1-il-Lys-DTPAtBut

0.5 mmol di lattosio sono state sciolte in 0.5 mL di acqua bidistillata e aggiunte ad una miscela costituita da 1.34 mmol di Lys-DTPA terbutilato disciolto in metanolo (6.266 mL),

0.733 mL di acido acetico glaciale e 70 mg di sodio cianoboroidruro. La soluzione risultante è stata incubata per 5 ore a 55 °C.

La purificazione del grezzo di reazione è stata ottenuta tramite HPLC utilizzando una colonna cromatografica a fase normale (fase amminica). Il prodotto è stato eluito isocraticamente con acetonitrile/acqua (90/10). Il sistema è stato collegato ad un raccoglitore di frazioni automatico e le frazioni pure sono state riunite e seccate per evaporazione sotto vuoto spinto (0.272 g, 50.8%).

Deprotezione di Lattit-1-il-Lys-DTPAtBut

0.254 mmol di lattit-1-il-Lys-DTPA terbutilato sono stati risospesi in 0.836 mL di diclorometano. 4.7 mL acido trifluoroacetico (TFA) sono stati aggiunti alla sospensione a 0°C, e la soluzione è stata mantenuta sotto agitazione a temperature ambiente per 48 ore. Il solvente è stato quindi rimosso per evaporazione sotto vuoto spinto ed il TFA è stato allontanato per successivi cicli di co-evaporazione con toluene (5 x 5 mL). E’ stato quindi ottenuto un olio giallo che è stato ridisciolto in acqua deionizzata e purificato su colonna ad esclusione dimensionale. Le frazioni pure sono state raccolte e concentrate dando il composto finale in forma completamente deprotetta (51.3 mg, 25.6%).

Lys-DTPA

1.34 mmol di Lys-DTPA terbutilato sono stati sciolti in 10 mL di TFA a 0 °C, quindi la soluzione è stata mantenuta sotto agitazione a temperature ambiente per 48 ore. L’acido trifluoroacetico è stato eliminato per co-evaporazione con toluene (5 x 10 mL) e portato a secco per mezzo di evaporazione sotto vuoto spinto. Il prodotto ottenuto è stato risospeso in acqua bidistillata e purificato su colonna ad esclusione dimensionale. Le frazioni pure sono state riunite e concentrate (343.36 mg, 55.22%).

Sintesi di Lattit-1-il-Lys-DTPA dal legante deprotetto

0.274 mmol di lattosio sono state disciolte in 1 mL di acqua bidistillata e aggiunte ad una miscela costituita da 0.74 mmol di Lys-DTPA completamente deprotetto disciolto in metanolo (3 mL), 0.350 mL di acido acetico glaciale e 70 mg di sodio cianoboroidruro. La soluzione risultante è stata mantenuta in una vial chiusa con tappo a vite a 55 °C over-night. La miscela di reazione è stata portata a secco per mezzo di evaporazione sotto vuoto spinto e ridisciolta in 5 mL di acqua bidistillata. La soluzione risultante è stata purificata su colonna ad esclusione dimensionale. Le frazioni pure sono state riunite e concentrate (47 mg, 22%).

Complesso Lattit-1-il-Lys-DTPA-Gd e Lattit-1-il-Lys-DTPA-La

Una soluzione acquosa di gadolinio cloruro (rapporto molare ligando/gadolinio pari a 1/1) oppure di lantanio cloruro è stata lentamente aggiunta a lattit-1-il-Lys-DTPA mantenendo il pH tra 6 e 7, per aggiunta di una soluzione 0.1 N di NH4OH. Dopo due ore la soluzione è stata concentrata e purificata su colonna ad esclusione dimensionale. Le frazioni pure eluite con acqua sono state sottoposte a test con xilenolo per la determinazione del gadolinio libero. Le frazioni risulte negative al test sono state unite e liofilizzate (resa, 61%).

Lys-AAZTA

0.3 mmol di Lys-AAZTA terbutilato sono state sciolte in 1.54 mL di TFA a 0°C e mantenute sotto agitazione a temperatura ambiente per 48 ore.

L’acido trifluoroacetico in eccesso è stato eliminato per co-evaporazione con toluene e l’olio ottenuto è stato risolubilizzato con acqua bidistillata. Il prodotto è stato purificato con colonna ad esclusione dimensionale. Le frazioni pure sono state riunite e concentrate (resa, 61%).

Sintesi di Lattit-1-il-Lys-AAZTA

0.063 mmol di lattosio sono stati sciolti in 0.189 mL di acqua bidistillata e aggiunti ad una miscela costituita da 0.15 mmol di Lys-AAZTA completamente deprotetto disciolto in metanolo (1.67 mL), 0.066 mL di acido acetico glaciale e 70 mg di sodio cianoboroidruro. La soluzione risultante è stata incubata a 55 °C overnight.

La miscela di reazione è stata portata a secco per mezzo di evaporazione sotto vuoto spinto e ridisciolta in 5 mL di acqua bidistillata. La soluzione risultante è stata purificata su colonna ad esclusione dimensionale. Le frazioni pure sono state riunite e concentrate (34.73 mg, 73%).

Complesso di Lattit-1-il-Lys-AAZTA-Gd

Ad una soluzione acquosa di gadolinio cloruro (rapporto molare ligando/gadolinio pari a 1/1) è stato aggiunto lentamente lattit-1-il-Lys-AAZTA mantenendo il pH tra 6 e 7, per aggiunta di una soluzione 0.1 N di NH4OH. Dopo due ore la soluzione è stata concentrata e caricata su una colonna ad esclusione dimensionale. Le frazioni pure eluite con acqua sono state sottoposte ad un test tramite xilenolo per la determinazione del gadolinio libero. Le frazioni risultanti negative al test sono state riunite e liofilizzate (resa, 60%).

Materiali

La Cianina 5.5 monofunzionale è stata fornita da GE Healthcare.

Il destrano coniugato con la cianina 5.5 (PM 70’000) è stato acquistato da NANOCS. Metodi

Il Chitlac e il chitosano sono stati coniugati alla cianina seguendo le indicazioni del fornitore della sonda. In breve, 1 mg di Chitlac o di chitosano sono stati sciolti in 1 mL di tampone bicarbonato di sodio 0.1 M a pH 9.2. Questa soluzione è stata aggiunta ad una fiala di Cy5.5 e lasciata agitare per 4 ore. La soluzione è stata quindi dializzata contro acqua bidistillata e successivamente liofilizzata.

Per l’iniezione endovenosa è stato utilizzato un Chitlac a basso peso molecolare derivatizzato con Cy5.5 come sopra descritto.