Interazioni Indipendenti e Cooperative

Una macromolecola dà luogo ad interazioni (“legami”) di tipo cooperativo se la sua affinità intrinseca nei confronti di un determinato ligando varia al variare della concentrazione del ligando. Si parlerà di cooperatività positiva se tale affinità aumenta all’aumentare della concentrazione di ligando. In altre parole, dopo che è avvenuta la prima interazione tra ligando e recettore è facilitato il legame di altre molecole di ligando sulla macromolecola. Naturalmente, affinché possa verificarsi un legame di tipo cooperativo è necessario che la macromolecola possegga più siti di legame, poiché la cooperatività è il risultato proprio dell'interazione tra i diversi siti di legame.

La cooperatività è una caratteristica essenziale di molti sistemi biochimici, in particolare degli enzimi e dei recettori.

Essa può risultare dal contributo all’energia di legame da parte di interazioni secondarie con il substrato o da effetti allosterici, come nel caso del legame dell’ossigeno all’emoglobina. Questo tipo di cooperatività prevede cambiamenti, indotti dal ligando, nella conformazione della proteina (Klein, 2003).

Un caso abbastanza complesso è quello dell'interazione tra molecole di natura saccaridica con proteine in grado di riconoscerle in modo specifico.

In natura è presente una grandissima varietà di sequenze di glicani, che possono essere portate da proteine (glicoproteine e proteoglicani) e lipidi (glicolipidi) a formare un “cappotto” sulla membrana cellulare. Ciascuna cellula produce una serie precisa di glicani contenenti informazioni strutturali uniche per quella particolare cellula. Proteine in grado di legare tali strutture, le GBP (Glycan-Binding Proteins) utilizzano i glicani per mediare meccanismi cellulari (Collins, 2004).

Alle GBP appartiene la famiglia delle galectine (per un approfondimento sulle galectine, si veda il capitolo III dell’Introduzione Generale).

Inoltre, anche virus e altri agenti patogeni sfruttano le GBP per aderire e colonizzarel’ospite e rilasciare le loro tossine. L’interazione tra queste proteine ed i loro ligandi avviene con un’affinità generalmente bassa, con una KD che va dal µM al mM e quindi con una KA

dell’ordine di 10³-10⁶ M^-1. In molti casi le interazioni multivalenti, originate dalla simultanea interazione tra più GBP ed i loro ligandi, compensano la bassa affinità dando origine a forze adesive sufficientemente elevate. Come illustrato in figura 2.1, le GBP possono essere in soluzione o ancorate alla membrana, in questo caso esse possono essere disperse oppure localizzate in microdomini sulla superficie della cellula.

Grazie alle grandi dimensioni e alla presentazione di glicani distribuiti in maniera casuale, i glicoconiugati di grandi dimensioni permettono legami multivalente alle GBP presenti sulla superficie di membrane cellulari o di piastre ELISA (Collins, 2004).

Un esempio dell’utilizzo in natura dei legami multivalenti è rappresentato dal richiamo dei leucociti nel sito d’infiammazione. Tale evento prevede l’interazione tra i glicani di superficie dei leucociti e le selectine esposte sull’endotelio vasale. Perché il fenomeno del rolling (primo evento per l’extravasazione delle cellule dell’immunità) avvenga, le selectine necessitano di legami multivalenti con i glicani con eventi rapidi di legame e rilascio. Anche la clusterizzazione delle selectine sui microvilli risulta importante affinchè il rolling avvenga.

Figura 2.1. Espressione delle GBP. a) Le GBP possono essere presenti come proteine

solubili o legate alla membrana cellulare; b) rappresentazione delle possibili distribuzioni delle GBP sulla superficie cellulare.

Per quanto riguarda le galectine, la struttura saccaridica riconosciuta è quella dei β-galattosidi, con una preferenza per le strutture disaccaridiche del lattosio e dell’N-acetillattosammina, che possono trovarsi sia in posizione terminale che all’interno della catena oligosaccaridica. Quando le galectine associano in modo dimerico, che è la modalità più comune, la struttura terziaria e quaternaria assunta presenta i due monomeri associati in modo non covalente in posizione opposta al sito di legame. Infatti i due siti di legame si trovano piuttosto distanti tra loro (circa 50 Å), posizionati sulle parti opposte di un dimero oblungo, e, cosa più importante,

i siti puntano in direzioni opposte (figura 2.2). Questa orientazione è completamente diversa da quella di molte proteine di membrana, come ad esempio le lectine epatiche, in cui i siti di legame puntano generalmente nella stessa direzione (Lee, 2000).

Figura 2.2. Struttura a nastro del complesso tra una Galectina dimerica e due molecole di lattosio.

L’affinità di legame delle galectine per i loro ligandi naturali è piuttosto bassa, e la KD è dell’ordine del mM. Ci sono casi tuttavia, nei quali l’affinità di legame risulta aumentata quando la struttura saccaridica che interagisce è più estesa ed è in grado di coprire altre aree della superficie proteica, e viene anche amplificata da interazioni proteina-proteina. Sia la clusterizzazione dei siti di legame della lectina, così come quella delle unità saccaridiche riconosciute (Lee, 2000) portano solitamente ad un notevole aumento di diversi ordini di grandezza dell’affinità di legame.

Bisogna però tenere presente il ruolo dell’orientazione e della direzione dei siti di legame. Quando i siti di legame puntano in due direzioni opposte, come nel caso delle galectine, è improbabile che una lectina riesca a legare un legante multivalente in più siti. Da un punto di vista sterico, l’interazione più semplice è il cross-linking della struttura proteica (figura 2.3) ed è prevedibile che un esteso cross-linking produca un aumento di affinità, dovuto probabilmente ad una diminuzione della velocità di dissociazione del substrato (Lee, 2000).

Figura 2.3. Modello di cross-linking tra galectine dimeriche in presenza di asialo fetuina (AsF). All’aumentare del numero di molecole di AsF, aumenta il rapporto AsF/Galectina.

Il legame tra glicani e GBP può essere di vario tipo (figura 2.4): l’interazione definita trans si esplica tra due cellule (tipica nei rapporti tra le cellule costituenti un tessuto) oppure tra una cellula e un agente patogeno, a cui può seguire l’evento di endocitosi; l’interazione di tipo cis è data dal legame glicano-GBP presenti sulla superficie della stessa cellula (un esempio è dato dalla lectina CD22 presente sulla superficie delle cellule B assieme al ligando glicanico da essa riconosciuto) (Collins, 2004).

Figura 2.4. Legame tra le GBP e i glicani. I legami tra GBP e i glicani possono essere di

diverso tipo permettendo interazioni che modulano l’attività cellulare e la sua risposta ad agenti patogeni. In (d) è rappresentata una tipica interazione che può avvenire tra la Galectina-1, dimerica, in soluzione e i glicani di superficie: il legame multivalente porta alla formazione di una struttura reticolare.