Andamento temporale dell’inibizione di STAT-1 determinata da SJW e HPF in cellule INS-1E

Abbiamo voluto indagare se l’inibizione dell’attivazione di STAT-1 indotta da citochine, persistesse variando il momento in cui aggiungevamo le sostanze protettive alla coltura di cellule INS-1E rispetto la miscela di citochine.

Come mostrato in Fig. 7.2 l’estratto di SJW (5 μg/ml) inibisce completamente l’attivazione di STAT-1 indotta dalla miscela di citochine (IFN-γ 400 U/μl; IL- 1β 50 U/μl; TNF-α 100 U/μl) quando introdotto 30 min prima delle citochine. Sorprendentemente l’inibizione di STAT-1 si verifica anche quando la sostanza vegetale viene aggiunta insieme o 15 minuti dopo le citochine, anche se la sua entità è lievemente minore. Quando il SJW è utilizzato a concentrazione inferiore (2 μg/ml), l’effetto inibitorio ha lo stesso andamento, ma di minore entità.

68 Anche l’HPF è in grado di inibire l’attivazione di STAT-1 indotta dalla nostra miscela di citochine quando aggiunto prima e tale effetto persiste,anche se di minore entità, quando aggiunta contemporaneamente o 15 minuti dopo (Fig. 7.3).

Fig. 7.2: Effetti del SJW sull’attivazione di STAT-1 indotta da citochine in cellule INS-1E. SJW (2 µg/ml e 5 µg/ml) è stato aggiunto alle cellule INS-1E 30 min

prima, simultaneamente o 15 min dopo la miscela di citochine (IFN-γ 400 U/ml + IL-1β 50 U/ml + TNF-α 100 U/ml) per un periodo di incubazione di 1 h. L’estratto nucleare (10 μg) da lisato cellulare è stato utilizzato per sviluppare il saggio EMSA dopo incubazione con oligonucleotide double-strand 32P-legato il quale riconosce la sequenza consenso per STAT-1.

In Fig. 7.3 mostra anche l’effetto di SJW sull’attivazione di STAT l’andamento è simile a quello d

pressoché completa

o 15 minuti dopo le citochine.

Le Fig. 7.4 e 7.5 mostrano la sintesi derivante da molti esperimenti simili a quelli riportati in Fig. 7.2 e 7.

Fig. 7.3: Effetti dell’estratto di SJW e HPF sull’attivazione di STAT citochine in cellule INS

INS-1E 1 h prima, simultaneamente o 15 min dopo la miscela di citochine (IFN U/ml + IL-1β 50 U/ml + TNF

L’estratto nucleare (10 μg) da lisato cellulare

EMSA dopo incubazione con oligonucleotide double riconosce la sequenza consenso per STAT

mostra anche l’effetto di SJW sull’attivazione di STAT l’andamento è simile a quello della figura precedente, ma l’inibizione è

anche quando il composto vegetale è aggiunto insieme o 15 minuti dopo le citochine.

Le Fig. 7.4 e 7.5 mostrano la sintesi derivante da molti esperimenti simili a quelli riportati in Fig. 7.2 e 7.3.

Fig. 7.3: Effetti dell’estratto di SJW e HPF sull’attivazione di STAT

citochine in cellule INS-1E. SJW (5 μg/ml) e HPF (1 μM) sono stati aggiunti alle cellule

1E 1 h prima, simultaneamente o 15 min dopo la miscela di citochine (IFN 1β 50 U/ml + TNF-α 100 U/ml) per un periodo di incubazione di 1 h. L’estratto nucleare (10 μg) da lisato cellulare è stato utilizzato per sviluppare il saggio EMSA dopo incubazione con oligonucleotide double-strand

riconosce la sequenza consenso per STAT-1.

69 mostra anche l’effetto di SJW sull’attivazione di STAT-1, ella figura precedente, ma l’inibizione è il composto vegetale è aggiunto insieme

Le Fig. 7.4 e 7.5 mostrano la sintesi derivante da molti esperimenti simili a Fig. 7.3: Effetti dell’estratto di SJW e HPF sull’attivazione di STAT-1 indotta da

sono stati aggiunti alle cellule 1E 1 h prima, simultaneamente o 15 min dopo la miscela di citochine (IFN-γ 400 α 100 U/ml) per un periodo di incubazione di 1 h. zato per sviluppare il saggio strand 32P-legato il quale

70 Fig. 7.4: Effetti dell’estratto di SJW sull’attivazione di STAT-1 indotto da citochine in cellule INS-1E in funzione della dose e del tempo di introduzione della sostanza. SJW

(2 μg/ml e 5 μg/ml) è stato aggiunto al mezzo di coltura delle INS-1E 2 h, 1 h, 30 min prima, contemporaneamente e 15 min, 30 min dopo la miscela di citochine. Dopo 60 min di esposizione alle citochine, le cellule sono state raccolte ed il loro estratto nucleare è stato utilizzato per valutare l’attivazione di STAT-1 mediante EMSA. I dati mostrano la media ± ESM di 4 osservazioni separate.

71 L’estratto di SJW inibisce completamente l’attivazione di STAT-1 indotta da citochine quando aggiunto prima (2 ore, 1 ora o 30 min) di esse, mentre tale effetto si riduce lievemente quando aggiunto 15 o 30 minuti dopo la miscela (Fig. 7.4). L’inibizione sembra essere lievemente inferiore quando il SJW è usato a concentrazione più bassa (2 μg/ml).

La Fig. 7.5 mostra che, anche quando abbiamo utilizzato l’iperforina come agente protettivo, l’effetto inibitorio su STAT-1 permane anche quando il componente vegetale è introdotto simultaneamente o successivamente al trattamento con citochine, similmente a quanto osservato con SJW. Anche per l’iperforina si evidenzia un effetto inibitorio maggiore per la dose più alta.

72 Fig. 7.5: Effetti di HPF sull’attivazione di STAT-1 indotto da citochine in cellule INS-1E in funzione della dose e del tempo di introduzione della sostanza. HPF (0,5

e 1 μM) è stato aggiunto al mezzo di coltura delle INS-1E 2 h, 1 h, 30 min prima, contemporaneamente e 15 min o 30 min dopo la miscela di citochine. Dopo 1 h di esposizione alle citochine, le cellule sono state raccolte ed il loro estratto nucleare è stato utilizzato per valutare l’attivazione di STAT-1 mediante EMSA. I dati mostrano la media ± ESM di 4 osservazioni separate.

73 Ci siamo dunque domandati quale fosse il massimo intervallo di tempo tra l’aggiunta della miscela di citochine alle cellule iNS-1E e quella delle sostanze protettive che ci permettesse di evidenziare ancora l’effetto inibitorio sull’attivazione di STAT-1.

La Fig. 7.6 mostra che il SJW (2 μg/ml) inibisce l’attivazione di STAT-1 se aggiunto insieme o dopo 30 min, seppure in maniera assai minore a quanto osservato negli esperimenti precedenti, mentre l’effetto inibitorio si affievolisce notevolmente quando la sostanza vegetale è aggiunta 60 o 90 minuti dopo le citochine.

Invece, l’iperforina sembra mantenere un buon effetto inibitorio su STAT-1 anche quando aggiunta 60 minuti dopo la miscela di citochine, effetto che si riduce notevolmente dopo 90 minuti.

74 Abbiamo, poi, voluto verificare se l’inibizione dell’attivazione di STAT-1 determinata dall’iperico e dall’iperforina nelle cellule INS-1E richiedesse necessariamente la continua presenza dell’estratto vegetale nel mezzo d’incubazione o se l’effetto inibitorio si ottenesse anche quando la sostanza

Fig. 7.6: Effetti dell’estratto di SJW e HPF sull’attivazione di STAT-1 indotta da citochine in cellule INS-1E. SJW (2 µg/ml) e HPF (2 µM) sono stati aggiunti alle

cellule INS-1E 2 h prima, simultaneamente, 30 min, 60 min, 90 min dopo la miscela di citochine (IFN-γ 400 U/ml + IL-1β 50 U/ml + TNF-α 100 U/ml) per un periodo di incubazione di 2 h. L’estratto nucleare (10 μg) da lisato cellulare è stato utilizzato per sviluppare il saggio EMSA dopo incubazione con oligonucleotide double-strand

75 vegetale veniva rimossa prima dell’esposizione a citochine. Pertanto, in alcuni esperimenti, dopo una pre-incubazione di durata variabile con l’estratto di SJW o l’HPF, il mezzo è stato rimosso e, dopo lavaggio, è stato aggiunto mezzo di coltura fresco, contenente le citochine ma senza le sostanze protettive.

I risultati in Fig. 7.7 mostrano che, quando l’iperico viene rimosso durante l’incubazione con citochine (corsia 4, 6, 9, 11), si ha ancora un’inibizione dell’attivazione di STAT-1, ma di entità minore rispetto a quando esso è presente sia nel periodo di pre-incubazione che durante l’incubazione. L’effetto inibitorio è dose dipendente e migliora aumentando il tempo di pre-incubazione con le sostanze vegetali.

76 La Fig. 7.8 mostra che anche l’iperforina continua ad inibire l’attivazione di STAT-1 quando rimossa prima dell’aggiunta delle citochine, e l’effetto è migliore aumentando il tempo di pre-incubazione in presenza della sostanza protettiva.

Fig. 7.7: Effetti dell’attivazione di STAT-1 indotto da citochine in seguito all’esposizione di SJW nelle cellule INS-1E. Le INS-1E sono state pre-incubate

con SJW alle concentrazioni 2 µg/ml e 5 μg/ml per 7 h o 30 min, e 3 h o 30 min rispettivamente. Le cellule sono state esposte per 1 h alla miscela di citochine (IFN-γ 400 U/ml + IL-1β 50 U/ml + TNF-α 100 U/ml) in presenza o assenza, a causa del lavaggio, delle sostanze protettive. Le cellule sono state raccolte ed il loro estratto nucleare è stato utilizzato per valutare l’attivazione di STAT-1 mediante EMSA.

Sorprendentemente, l’iperforina preserva un buon effetto protettivo, seppure ridotto rispetto ai

dal mezzo si attende 1 ora prima di aggiungere le citochine.

Fig. 7.8: Effetti dell’attivazione di STAT all’esposizione di HPF nelle cellule INS

mezzo di coltura delle cellule INS

mezzo è stato rimosso, le cellule lavate ed è stato aggiunto terreno fresco contenente la miscela di citochine con o senza HPF, immediatamente o 1 h dopo. Dopo 60 min di esposizione alle citochine, le cellule sono state raccolte ed il loro estratto nucleare è stato util

1 mediante EMSA.

Sorprendentemente, l’iperforina preserva un buon effetto protettivo, e ridotto rispetto ai precedenti, anche quando, dopo averla rimossa dal mezzo si attende 1 ora prima di aggiungere le citochine.

Fig. 7.8: Effetti dell’attivazione di STAT-1 indotto da citochine in seguito all’esposizione di HPF nelle cellule INS-1E. HPF (0.5 μM) è stato aggiunto al

mezzo di coltura delle cellule INS-1E per 4 h o 2 h di preincubazione. Poi il rimosso, le cellule lavate ed è stato aggiunto terreno fresco contenente la miscela di citochine con o senza HPF, immediatamente o 1 h dopo. Dopo 60 min di esposizione alle citochine, le cellule sono state raccolte ed il loro estratto nucleare è stato utilizzato per valutare l’attivazione di STAT 1 mediante EMSA.

77 Sorprendentemente, l’iperforina preserva un buon effetto protettivo, dopo averla rimossa dal mezzo si attende 1 ora prima di aggiungere le citochine.