Materiali e Metod
1 indotto da citochine in seguito
7.4 Valutazione dell’apoptosi in cellule INS-1E
Abbiamo quindi voluto verificare l’effetto del SJW e dell’HPF sull’apoptosi indotta da citochine in cellule INS-1E, mediante dosaggio dell’attività della caspasi-3, ritenuta un indice attendibile di apoptosi dal momento che è una caspasi effettrice e quindi interviene nelle fasi tardive del processo. La Fig. 7.12 mostra che la miscela di citochine utilizzata determina un cospicuo aumento dell’apoptosinelle cellule INS-1E dopo un’esposizione di 6 ore. Se nel terreno di coltura è presente l’estratto di SJW a concentrazioni crescenti, l’attività della caspasi-3 diminuisce in maniera dose-dipendente, pur mantenendosi più alta di quella delle cellule di controllo. Anche l’iperforina è in grado di prevenire, in maniera simile all’iperico, l’attivazione della caspasi- 3 indotta da citochine quando presente nel mezzo di coltura.
84 Fig. 7.12: Effetto inibitorio dose-dipendente dell’estratto di SJW e HPF sull’apoptosi indotta da citochine in cellule INS-1E, valutata attraverso l’attività della caspasi-3. Le cellule INS-1E sono state esposte simultaneamente per 6 h ad
una miscela di citochine (IFN-γ 400U/ml + IL-1β 50U/ml + TNF-α 100U/ml) e due dosi di SJW (2μg/ml e 5 μg/ml) e HPF (1μM e 2 μM). L’attività della caspasi-3 è determinata usando il dosaggio luminometrico Caspase-Glo™3/7. I dati sono espressi come percentuale dei controlli e sono riportate le medie ± ESM di 8 osservazioni provenienti da 3 esperimenti separati.
*p < 0,05 rispetto al controllo; § p < 0,01 rispetto al trattamento con citochine.
0 100 200 300 400 500 600
C MIX MIX+SJW2 MIX+SJW5 MIX+HPF1 MIX+HPF2
C A S P A S E -3 -A C T IV IT Y (% o f c o n tr o ls ) * * § § §
85
Capitolo 8
Discussione
Lo scopo principale di questo studio è stato quello di approfondire la valutazione dell’effetto protettivo di un estratto di origine vegetale, l’iperico, noto in fitoterapia per i suoi effetti antidepressivi, e di un suo componente, l’iperforina, nei confronti del danno indotto dalle citochine nelle cellule β pancreatiche, che si ritiene sia il meccanismo patogenetico fondamentale dell’insorgenza del diabete mellito di tipo 1. Infatti, il diabete di tipo 1 si sviluppa in seguito ad una reazione infiammatoria durante la quale i linfociti e i macrofagi, attivati con meccanismo autoimmunitario, infiltrano le isole pancreatiche di Langherans e rilasciano citochine (in particolare IFN-γ, IL-1β e TNFα) che inducono la distruzione, per apoptosi o necrosi, delle cellule β e la permanente carenza di insulina che ne consegue (Eizirik et al. 2001).
L’idea di verificare l’effetto di questo estratto vegetale sulle cellule β pancreatiche è stata stimolata da osservazioni fatte da nostri collaboratori dell’Università di Verona nel corso di esperimenti volti a valutare l’attività inibitoria di composti naturali in linee cellulari tumorali di origine umana. Il gruppo di Verona aveva infatti dimostrato che l’estratto di Hypericum
86 perforatum ha un effetto inibitorio rilevante sull’attivazione di STAT-1 indotta da citochine in alcune linee cellulari tumorali umane (Dupraz et al. 2000).
Poiché negli ultimi anni è stato dimostrato che l’attivazione del fattore di trascrizione STAT-1 è il meccanismo fondamentale dell’azione dell’IFN-γ in vari tipi cellulari, comprese le cellule β; si è voluto indagare se questo estratto vegetale avesse il medesimo effetto sulle cellule β pancreatiche. I primi risultati ottenuti hanno messo in evidenza che l’estratto di iperico e l’iperforina sono in grado di inibire in maniera dose-dipendente non solo l’attivazione di STAT-1 indotta dalle citochine, ma anche quella di NF-kB, nella linea INS-1E di derivazione β cellulare. L’iperforina è il componente dell’estratto di SJW principalmente responsabile dell’inibizione dell’attivazione di STAT-1 e probabilmente anche l’unico, considerando il fatto che gli esperimenti svolti hanno escluso un effetto significativo di altri componenti. E’ stato inoltre dimostrato che sia il SJW che l’iperforina determinano una inibizione dose-dipendente dell’espressione del gene della NO sintetasi inducibile (iNOS), che viene sinergicamente potenziata dall’attivazione concomitante dei due fattori di trascrizione STAT-1 e NF-kB, indotta da una miscela di citochine. Inoltre, i due composti vegetali si sono dimostrati in grado di proteggere, in maniera dose-dipendente, le cellule INS-1E dall’apoptosi causata dalle citochine.
87 L’estratto di SJW e l’iperforina hanno evidenziato il loro effetto inibitorio sull’attivazione di STAT-1 anche in isole di Langerhans isolate di ratto ed umane. Nelle isole isolate esposte a citochine, l’estratto di SJW e l’iperforina inducono anche una chiara inibizione dose-dipendente dell’attivazione di NF- kB, anche se tale inibizione non arriva ad essere totale come per STAT-1. SJW previene nelle isole isolate sia di ratto che umane l’apoptosi e la necrosi indotte da citochine, mentre HPF determina una protezione solo parziale. La morte β-cellulare indotta da citochine può derivare sia da un processo di apoptosi che di necrosi e risulta dipendente non solo dall’attivazione dell’espressione di geni direttamente pro-apoptotici da parte di STAT-1 e/o NF-kB, ma anche di quella del gene che codifica per la forma inducibile di NO sintetasi (iNOS) (Eizirik et al. 2001).
Gli studi a cui ho partecipato hanno utilizzato la linea cellulare INS-1E, essendo tali cellule ampiamente utilizzate nella ricerca diabetologica e considerate una valida alternativa, almeno in prima istanza, alle cellule β delle isole di Langerhans in tutti i casi in cui la disponibilità limitata delle isole non consenta indagini approfondite.
Tali studi hanno dimostrato che nella linea cellulare INS-1E, l’inibizione, seppure attenuata, dell’attivazione di STAT-1 indotta da citochine si osserva anche quando l’estratto di SJW ed il suo componente iperforina sono aggiunti 15, 30, 60 minuti dopo l’esposizione delle cellule alle citochine.
88 Questa osservazione ci fornisce delle indicazioni riguardo alle modalità di azione dei due composti vegetali. Infatti possiamo escludere che essi interferiscano con i recettori di membrana su cui agiscono le citochine utilizzate. Probabilmente, l’iperico e l’iperforina penetrano, essendo sostanze liposolubili nella membrana delle cellule β, e poi interferiscono stericamente con i siti di fosforilazione dei componenti dei sistemi di trasduzione del segnale, come dimostrano altri risultati ottenuti dal gruppo di ricerca (Masiello et al. 2012). L’azione inibitoria delle sostanze vegetali si ottiene anche quando SJW e HPF vengono aggiunti successivamente alle citochine, probabilmente perchè nelle cellule β, a differenza di quanto osservato nella maggioranza delle altre cellule (Shuai et al. 1992; Haspel et al. 1996), l’attivazione di STAT-1 permane per periodi molto lunghi: il fattore di trascrizione viene rapidamente attivato da IFN-γ, raggiunge un picco dopo 30 minuti e declina entro 1-4 ore. Nelle cellule β pancreatiche, invece, l'attivazione di STAT-1 indotta da IFN-γ ha una durata sorprendentemente lunga ed è in grado di persistere anche per 8-24 ore: si pensa che in queste cellule il segnale di IFN-γ persista finché la citochina è presente e termini solo quando quest’ultima viene rimossa, molto probabilmente tramite defosforilazione ad opera di una fosfatasi tirosinica nucleare (Chong et al. 2001).
89 Sorprendentemente, gli agenti protettivi studiati, mantengono il loro effetto inibitorio su STAT-1 anche quando sono rimossi dal mezzo di incubazione prima dell’aggiunta della miscela di citochine. Sembra quindi che tali composti vegetali, conferiscano alle cellule β uno stato di “resistenza alle citochine”, almeno per quanto concerne l’attivazione di STAT-1, che può essere indotto sia prima che dopo l’esposizione a tali fattori.
Gli studi a cui ho partecipato hanno inoltre dimostrato che l’iperico e l’iperforina contrastano l’inibizione indotta dalle citochine, dell’espressione di geni che hanno particolare importanza per l’induzione ed il mantenimento del fenotipo differenziato nelle cellule β pancreatiche. Studi di microarray avevano dimostrato che miscele di citochine inibiscono l’espressione di geni direttamente correlati alla funzione delle cellule β differenziate,quali INS-1E, ma anche di altri geni che funzionano come master regulatory transcription factors (PDX-1, Pax6, Foxo1) (Ortis et al. 2010; Zhou et al. 2008).
Il fattore di trascrizione PDX-1 gioca un ruolo rilevante non solo nello sviluppo del pancreas, ma anche nella differenziazione delle cellule β e nel mantenimento della loro normale funzione, regolando l’espressione di geni cruciali inclusi quelli di insulina, GLUT2 glucochinasi (Kaneto et al. 2008; Olbrot et al. 2002). Vari fattori (ROS, citochine, aumento degli FFA, stress del reticolo), soprattutto mediante l’attivazione della via di JNK, favoriscono la
90 traslocazione di PDX-1 dal nucleo al citoplasma, limitando in tal modo la sua attività trascrizionale e la biosintesi di insulina (Kawamori et al. 2003).
Anche il fattore di trascrizione Pax6 contribuisce allo sviluppo del pancreas endocrino, oltre che esercitare un ruolo cruciale nello sviluppo di occhi, cervello e sistema olfattivo (Simpson et al. 2002). Inoltre, Pax6 è necessario per il corretto sviluppo e organizzazione spaziale di tutti i precursori delle cellule delle isole pancreatiche (St-Onge et al. 1997; Sander et al. 1997). Studi recenti hanno dimostrato che Pax6 è essenziale nell’adulto per mantenere l’omeostasi del glucosio e la funzione del pancreas endocrino (Hart et al. 2013). Si suppone che PDX-1 e Pax6 possano essere strettamente collegati nel sistema di regolazione genica per lo sviluppo e il mantenimento del pancreas (Davidson 2010).
FOXO1 inibisce la replicazione delle cellule β aumentando l’espressione di inibitori del ciclo cellulare e sopprimendo la trascrizione di PDX1. FOXO1 inibisce anche la neogenesi delle cellule β e previene la de-differenziazione e il mantenimento della funzione delle cellule β sopprimendo l’espressione di neurogenina 3. Inoltre, FOXO1 protegge le cellule β dallo stress ossidativo aumentando l’espressione di enzimi antiossidanti (Kitamura et al. 2013). L’espressione di tutti i geni considerati viene significativamente inibita dal trattamento con citochine e l’evidenza che questa inibizione è presente già dopo 6 ore di esposizione alle citochine suggerisce un effetto precoce e
91 specifico. La concomitante presenza delle sostanze vegetali preserva i livelli di espressione genica delle cellule di controllo.
Infine, i risultati ottenuti mostrano che le sostanze vegetali sono capaci di proteggere le cellule INS-1E dalla morte per apoptosi correggendo lo sbilanciamento indotto dalle citochine tra fattori anti- e pro-apoptotici, prevenendo l’aumento delle proteine pro-apoptotiche e preservandone alcune antiapoptotiche.
Ricordiamo che le citochine proinfiammatorie IFN-γ, IL-1β e TNF-α giocano un ruolo importante nell’apoptosi delle cellule β nel diabete autoimmune. Molti esperimenti in vitro suggeriscono che l’attivazione di NF-kB sia determinante per indurre l’apoptosi nelle cellule β (Ortis et al. 2008; Cardozo et al. 2001; Heimberg et al. 2001; Kutlu et al. 2003), cosicchè tale fattore è considerato pro-apoptotico nelle cellule β, mentre è anti-apoptotico in molti altri tipi cellulari (Wang et al. 1998; Beg et al. 1996). L’inibizione dell’espressione di NF-kB in vitro e in vivo previene l’apoptosi delle cellule β indotta da citochine IL-1β e TNF-α (Eldor et al. 2006; Ortis et al. 2008) e ha permesso di identificare molti mediatori chiave della disfunzione e morte di tali cellule, inclusi i fattori correlati allo stress del reticolo, attraverso analisi di array (Cardozo et al. 2001; Cardozo et al. 2005). Quando le cellule β sono esposte a IFN-γ si ha l’attivazione di un altro fattore di trascrizione, STAT-1. Anche l’inibizione di STAT-1 previene la morte delle cellule β indotto dalle
92 citochine in vitro e nel diabete autoimmune sperimentale provocato da multiple basse dosi di streptozotocina (Callewaert et al. 2007; Gysemans et al. 2005). STAT-1 svolge una regolazione positiva sulla proteina pro- apoptotica DP5 (death protein 5/Hrk) e sulla sintesi di molte chemochine proinfiammatorie, mentre regola negativamente geni coinvolti nel differenziamento e nella funzione delle cellule β (Moore et al. 2011). Recentemente è stato dimostrato che DP5 ha un ruolo centrale nella morte delle cellule β indotta sia dalle citochine che da stress del reticolo endoplasmatico (Gurzov et al. 2009). Anche molti altri geni correlati all’apoptosi quali PUMA, CHOP (Ddit3), Bax, Bid sono differenzialmente regolati inseguito al knock down di STAT-1 e possono contribuire all’apoptosi indotta da citochine nelle cellule β (Moore et al. 2011). Inseguito all’esposizione alle citochine TNF-α e IFN-γ viene indotta l’espressione di Bim, attraverso l’attivazione di STAT-1; questo evento insieme con l’aumento di DP5 e PUMA e l’inattivazione di Bcl-XL è critico per la morte delle cellule β (Barthson et al. 2011).
Considerando nel complesso i risultati ottenuti in questi studi nelle cellule INS-1E, si evidenzia che l’estratto di SJW e il suo componente HPF mostrano proprietà protettive simili, a differenza di quanto ottenuto nelle isole isolate di ratto o umane, dove HPF risultava meno efficace rispetto all’estratto. Bisogna considerare che in questi esperimenti i tempi di incubazione in
93 presenza delle sostanze vegetali sono brevi (massimo 8 ore) e insufficienti perché l’HPF subisca processi di degradazione ossidativi e/o possa generare metabolici tossici.
Questi risultati nel loro complesso appaiono molto promettenti e indicano che l’iperico e l’iperforina rappresentano un approccio farmacologico che merita di essere preso in considerazione e adeguatamente sviluppato per prevenire o ritardare la distruzione delle cellule β conseguente ad una reazione infiammatoria su base immunitaria.
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