ANIMALI

I campioni raccolti derivano da un campionamento effettuato durante la stagione venatoria 2011-2012 in diverse zone della provincia di Pisa. Nella Figura 8 è mostrata la cartina politica della provincia con indicati i comuni e il relativo numero di campioni. Ogni soggetto è stato classificato in base al sesso ed alla classe di età. É stato deciso di utilizzare tre classi di età: giovane, subadulto e adulto. Ad ogni zona di prelievo è stato assegnato un codice alfanumerico con cui contrassegnare i soggetti. Sono stati prelevati un totale di 64 soggetti, 31 femmine e 26 maschi, 26 adulti e 26 subadulti. Dei 64 soggetti, 2 sono privi del campione di feci e sangue e 12 non sono stati classificati secondo la classe di età e sesso.Da ogni soggetto sono stati raccolti: un campione di feci, un campione di sangue intero, e due campioni di fegato, uno da conservare a –20°C per la biologia molecolare ed una porzione

d2

Figura 8 Cartina politica della Provincia Pisana con i comuni e i relativi campioni prelevati

25

8

22

9

rappresentativa del fegato di circa 3x3cm, fissata in formalina

tamponata al 10% (pH 7,4) per le successive indagini istopatologiche.

5.3 METODICHE DI DIAGNOSI DIRETTA 5.3.1 Nested-PCR su pool di campioni fecali 5.3.1.1 Estrazione del RNA virale

I campioni fecali sono stati suddivisi in 19 pool per luogo di prelievo e classe di età. In tabella 3 sono riportati i soggetti componenti i pool con luogo di prelievo classe di età e sesso.

Tabella 3:Riepilogo dei soggetti componenti i pool: identificazione, zona di prelievo, classe di età e sesso.

Ogni pool è stato costituito con circa 3 grammi di feci, composti da parti uguali di ogni campione, pesate con una bilancia di precisione e raccolte in una provetta da 50 ml. Ad ogni provetta è stato aggiunto il 10% P/V di PBS 1X e delle sfere di vetro per facilitare

Pool Soggetto Zona di prelievo Classe di età Sesso Pool Soggetto Zona di prelievo Classe di età Sesso

L1 Pomarance S F P1 Comuni dei Monti Pisani S M L2 Pomarance S F P2 Comuni dei Monti Pisani A M L3 Pomarance S M P3 Comuni dei Monti Pisani

L4 Pomarance A F P4 Comuni dei Monti Pisani SR2 Pomarance A F P5 Comuni dei Monti Pisani SR3 Pomarance A F P6 Comuni dei Monti Pisani SR5 Pomarance A F P7 Comuni dei Monti Pisani SR6 Pomarance A F P8 Comuni dei Monti Pisani SR7 Pomarance A F P9 Comuni dei Monti Pisani

SR8 Pomarance A F S27 Chianni A F SR9 Pomarance A F S28 Chianni A F SR22 Pomarance A F S30 Chianni A F SR1 Pomarance A M S31 Chianni A F SR21 Pomarance A M S32 Chianni A F SR25 Pomarance A M S13 Chianni A M SR4 Pomarance S F S14 Chianni A M SR12 Pomarance S F S25 Chianni A M SR13 Pomarance S F S26 Chianni A M SR14 Pomarance S F S29 Chianni A M SR23 Pomarance S F S12 Chianni G M SR24 Pomarance S F S15 Chianni G M SR26 Pomarance S F S24 Chianni S F SR27 Pomarance S F S11 Chianni S M SR10 Pomarance S M S16 Chianni S M SR11 Pomarance S M S17 Chianni S M M1 Montecatini Val di Cecina M S18 Chianni S M M2 Montecatini Val di Cecina F S19 Chianni S M M3 Montecatini Val di Cecina F S20 Chianni S M M4 Montecatini Val di Cecina F S21 Chianni S M M5 Montecatini Val di Cecina F S22 Chianni S M S1 Montecatini Val di Cecina A M S23 Chianni S M S2 Montecatini Val di Cecina A F

S3 Montecatini Val di Cecina A F

6 16 17 7 18 8 19 9 4 14 5 15 1 10 11 2 12 3 13

l'omogeneneizzazione. Le provette sono state quindi agitate su un Vortex e centrifugate per 20 ' a 3000 rpm a 4°C. Il surnatante è stato quindi raccolto in provette da 2 ml e centrifugato per 10 ' a 14000 rpm. Il surnatante è stato quindi trasferito su altre provette da 2 ml e stoccato a -20°C.

5.3.1.1.1 Estrazione RNA

Per l'estrazione del RNA è stato utilizzato il kit QIAGEN ® QIAamp ® Viral RNA utilizzando lo spin protocol e effettuando l'eluizione con due passaggi di buffer AVE, in modo da incrementare fino al 10% la raccolta di RNA, come consigliato dal manuale di uso del kit. Questo kit sfrutta le proprietà selettive chelanti di una membrana di gel silicato su cui il materiale è fatto correre grazie ad una centrifuga. Due aliquote per ogni pool sono state trattate separatamente fino al momento del passaggio sulla membrana, dove sono state riunite per assicurare una maggiore resa di RNA.

5.3.1.1.2 Retrotrascrizione

Per la retrotrascrizione del RNA in cDNA, è stato utilizzato il kit QIAGEN ® QuantiTect ® Reverse transcription. La retrotrascrizione comprende una prima fase di eliminazione di DNA genomico, appartenente a cellule presenti nel campione e eventualmente estratto insieme al RNA, ed una seconda fase di retrotrascrizione vera e propria.

5.3.1.2 Prima PCR

È stata effettuata una prima PCR utilizzando il kit QIAGEN ® HotStartTaq DNA Polymerase con i primer esterni 3156 e 3157 secondo il protocollo proposto da Meng (47). In tabella 4 e 5 sono mostrate le sequenze dei primers e la loro posizione nel genoma di

HEV; e le caratteristiche dei cicli di amplificazione. I prodotti della Nested PCR sono stati fatti correre su gel al 2% di agarosio utilizzando il marker MassRuler™ Low Range DNA Ladder, ready-to- use fermentas.

Tabella 4: Sequenze dei primers utilizzati per la prima PCR e loro posizione nel genoma di HEV

Primer Sequenza Posizione nel genoma

3156-EF Senso AAYTATGCMCAGTACCGGGTTG 5687-5708

3157-ER Antisenso

CCCTTATCCTGCTGAGCATTCTC 6395-6417

Tabella 5: Valori di temperatura, tempo e numero di cicli

Temperatura (°C) Tempo (minuti) Numero di cicli

Denaturazione 95 15 1 Denaturazione 94 0,5 Annealing 60 0,5 Estensione 72 1 40 Estensione finale 72 10 1 4 ∞ ∞ 5.3.1.2 Nested-PCR

La nested-PCR è stata condotta utilizzando lo stesso kit della precedente ma impiegando dei primer interni, 3158 e 3159 (37, 47). In tabella 6 e 7 sono mostrate le sequenze dei primers, la loro posizione nel genoma di HEV; e le caratteristiche dei cicli di amplificazione. Il prodotto atteso della nested è un peptide di 347 bp.

Tabella 6: Sequenze dei primers utilizzati per la Nested-PCR e loro posizione nel genoma di HEV

Primer Sequenza Posizione nel genoma

3158-EF Sense GTYATGYTYYGCATACATGGCT 5972-5993

Tabella 7: Valori di temperatura, tempo e numero di cicli della nested PCR

Temperatura (°C) Tempo (minuti) Numero di cicli

Denaturazione 95 15 1 Denaturazione 94 0,5 Annealing 55 0,5 Estensione 72 1 40 Estensione finale 72 10 1 4 ∞ ∞

5.3.2 Nested-PCR su campioni singoli

I campioni componenti i pool risultati positivi alla prima Nested- PCR, sono stati analizzati singolarmente secondo il protocollo sopradescritto. Per i soggetti per i quali il quantitativo di feci è risultato insufficiente per una seconda analisi, sono stati utilizzati i campioni di fegato. L’estrazione dell’RNA è stata preceduta da un trattamento con il QIAGEN Tyssue-Liser ®.

5.4 METODICHE DI DIAGNOSI INDIRETTA