Attività enzimatica nel formaggio

La possibilità di determinare l’attività enzimatica anche nei prodotti di trasformazione dell’industria casearia è fondamentale per proporre gli enzimi in oggetto quali marker per i trattamenti termici. Tuttavia non sempre infatti tale condizione è realizzabile: ad esempio, la marcata idrosolubilità che caratterizza alcuni enzimi ne provoca, durate il processo di caseificazione, il trasferimento pressoché totale nel siero. La maggior sensibilità della metodica HPLC ha permesso di compiere significativi progressi anche nella determinazione di tali enzimi in prodotti derivati quale, ad esempio, il formaggio, matrice che in precedenza si era dimostrata non facilmente analizzabile per via spettrofotometrica. A tal proposito è stata determinata l’attività enzimatica di entrambi gli enzimi in nove formaggi a 3,5 mesi di maturazione e in due formaggi a sei mesi di maturazione per i quali l’attività enzimatica nel latte d’origine era stata precedentemente accertata. I formaggi realizzati da 5 differenti produttori artigianali sono del tipo Fiore Sardo DOP, formaggio ovino tipico delle produzioni a latte crudo in Sardegna (Capitolo 3) (Figura 9-3). Questa prima indagine conoscitiva non aveva comunque lo scopo di studiare le correlazioni che intercorrono tra i formaggi provenienti da diversi produttori ma semplicemente quello di accertare la determinabilità di entrambi gli enzimi nella matrice formaggio.

I protocolli RP-HPLC per la determinazione di entrambi gli enzimi nel formaggio differisco da quelli relativi al latte solo per la preparazione del campione. 10 g di formaggio grattugiato vengono pesati esattamente e sospesi in un volume finale di 50 mL di acqua distillata. La sospensione viene omogeneizzata per 5 min in uno stomacher (omogeneizzatore a battuta, che agisce mediante meccanismi di disgregazione e di agitazione) e quindi filtrata. Il filtrato viene quindi trattato in maniera assolutamente analoga al latte rispetto alle metodiche per tale matrice messe a punto (Capitolo 6).

La precisione, espressa in termini di ripetibilità, associata alla determinazione RP- HPLC degli enzimi nel formaggio è risultata di poco peggiore di quanto ottenuto nel caso del latte (Tabella 9-12).

C.V.% (n=10) Matrice γ-glutamiltransferasi α-L-fucosidasi Latte 2,9 4,5 Formaggio 3,5 5,1 Tabella 9-12

I valori di attività enzimatica dell’α-L-fucosidasi e della γ-glutamiltransferasi riferiti ai formaggi a 3,5 mesi di maturazione realizzati artigianalmente da tre produttori durante tre diverse lavorazioni sono riportate nella Tabella 9-13.

Lavorazioni Produttore 1 2 3 α-L-fucosidasi (U/gss) A 25,08 ± 0,28 28,03 ± 0,91 23,71 ± 0,56 B 13,39 ± 0,65 10,08 ± 0,54 15,61 ± 1,69 C 11,74 ± 1,92 10,08 ± 0,19 19,14 ± 1,38 γ-glutamiltransferasi (U/gss) A 1,23 ± 0,01 1,36 ± 0,01 1,60 ± 0,12 B 1,49 ± 0,16 1,98 ± 0,28 1,85 ± 0,01 C 1,97 ± 0,04 1,81 ± 0,16 2,10 ± 0,20

gss = grammi riferiti alla sostanza secca

Tabella 9-13

L’attività enzimatica dell’α-L-fucosidasi e della γ-glutamiltransferasi è stata determinata anche in campioni di Fiore Sardo DOP a 6 mesi di maturazione nei quali era stata precedentemente accertata l’attività enzimatica nel latte d’origine e nel formaggio a 3,5 mesi di maturazione (Tabella 9-14).

Mesi di maturazione Produttore 3,5 6 α-L-fucosidasi (U/gss) D 15,58 ± 0,84 18,07 ± 0,61 E 14,18 ± 1,69 24,96 ± 0,11 γ-glutamiltransferasi (U/gss) D 2,60 ± 0,13 1,96 ± 0,18 E 1,38 ± 0,02 1,47 ± 0,10

gss = grammi riferiti alla sostanza secca

Tabella 9-14

Attraverso il protocollo RP-HPLC, messo a punto in questo lavoro di Tesi, è stato possibile determinare entrambi gli enzimi nel formaggio a 3,5 e a 6 mesi di maturazione, queste determinazioni sono risultate del tutto originali per quanto riguarda l’α-L-fucosidasi nel formaggio, mentre l’attività della γ-glutamiltransferasi era stata precedentemente determinata sulla tale matrice solo un’altra volta, per via spettrofotometrica [Humbert et al., 2002] nel Camembert, formaggio vaccino a latte crudo di produzione Francese.

9.5 Conclusioni

Lo studio della dipendenza dell’attività enzimatica dell’α-L-fucosidasi e della γ- glutamiltransferasi in funzione delle variabili chimico-fisiche, stagionali e zootecniche è stato condotto su un gruppo sperimentale (n = 36) di pecore di razza Sarda messo a disposizione dall’azienda AGRIS Sardegna. Sono state registrate strette analogie tra latte bovino ed ovino per quanto attiene i valori di pH ottimali per la determinazione dell’attività enzimatica dell’α-L-fucosidasi e della γ-glutamiltransferasi. La scrematura del latte ha influenza solo per l’attività enzimatica della γ- glutamiltransferasi che scende, per effetto di tal trattamento, di circa un terzo. Anche questi dati sono in buon accordo con quelli bibliografici relativi al latte bovino. E’ stato evidenziato che esiste un significativo incremento dell’attività enzimatica in funzione della stagionalità (dai primi agli ultimi mesi di lattazione), forte per l’ α-L-fucosidasi, meno evidente, ma presente, per la γ-glutamiltransferasi. Sono state messe in evidenza e discusse le differenze che a riguardo sono emerse nei confronti del latte di massa di origine bovina. Si sono evidenziate differenze statisticamente significative in funzione delle due diverse mungiture alle quali sono giornalmente sottoposti gli animali (mattina e sera), mentre sembrano non influire l’alimentazione integrativa e il carico di pascolamento. Lo studio ha permesso di delineare i valori medi e range tipici delle attività enzimatiche nel latte ovino nell’arco dell’annata produttiva. Un approccio multivariato all’analisi dei dati ottenuti, realizzato mediante PCA, ha permesso di evidenziare che la componente principale interpreta la macrocomposizione chimica ed enzimatica del latte (correlazione diretta degli enzimi con grasso, proteine e loro correlazione inversa con il lattosio), mentre la seconda pare associabile a parametri che monitorano lo stato di benessere del gregge. L’analisi degli oggetti permette di confermare l’influenza del periodo della lattazione, ma non quella della tipologia dell’alimentazione e del carico. E’ interessante notare la non correlazione tra α-L-fucosidasi e cellule somatiche. In altre circostanze l’attività di enzimi lisozimiali (quale la α-L-fucosidasi) è apparsa strettamente correlata alla concentrazione di cellule somatiche (Capitolo 2), in quanto la lisi di esse provoca il rilascio nel latte di enzimi di origine cellulare. Vi è però da rimarcare che nessun dato in tal senso è presente in letteratura per l’α-L-fucosidasi.

La determinazione di entrambi gli enzimi è stata infine testata sia su latte proveniente da allevamenti estensivi che all’interno del formaggio Fiore Sardo DOP a 3,5 e a 6 mesi di maturazione. Le attività enzimatiche misurate sul latte da allevamenti estensivi non si discosta tangibilmente da quella misurata per i greggi sperimentali, mentre il successo della determinazione delle attività enzimatiche nei formaggi conferma che tale parametro è determinabile con i protocolli proposti lungo tutta la filiera produttiva, aprendo importanti prospettive per la loro applicabilità al fine di evidenziare trattamenti termici subiti dal latte prima della caseificazione.