ATTIVITA’ DI ANIDRASI CARBONICA

Accertato che gli organismi sentinella traslocati per 45 giorni nel sito Rada di Augusta hanno manifestato evidenti segni di stress dovuti ad esposizione a contaminanti, si è passati allo studio dell’attività di AC nei tessuti branchie, mantello e ghiandola digestiva quale nuovo biomarker di esposizione a contaminazione chimica ambientale.

L’attività di anidrasi carbonica nei tre tessuti è stata dosata mediante un protocollo di tipo elettrometrico basato sulla misura della velocità di variazione di pH di una soluzione di omogenato di ghiandola digestiva alla quale venga aggiunta acqua saturata con CO2.

3.3.1.4.1. ATTIVITA’ DI ANIDRASI CARBONICA IN GHIANDOLA DIGESTIVA

In figura 24 è riportata l’attività specifica di AC di un campione di 48 tessuti di ghiandola digestiva prelevati da organismi sentinella traslocati per 45 giorni nel sito di riferimento di Brucoli e nel sito ad impatto antropico Rada di Augusta (12 individui per ciascun sito di traslocazione) nel corso della campagna di campionamento invernale (Time 1) condotta nel periodo novembre-dicembre 2013 e della campagna estiva (Time 2) condotta nel periodo giugno- luglio 2014. L’attività enzimatica è espressa come Unità Internazionali d’enzima (µmol di H+ sviluppate al minuto) per grammo di tessuto fresco. Le barre di errore rappresentano l’errore standard.

Figura 24. Livelli di attività di AC specifica espressi come U internazionali d’enzima (µmol min-1)

x g-1 di tessuto fresco determinati in ghiandola digestiva di M. galloprovincialis esposti nei siti di Brucoli e Rada di Augusta nella campagna invernale (time 1) ed estiva (time 2). I dati sono espressi come media ±E.S. di 12 esemplari per ogni gruppo.

In figura si può osservare come nel Time 1 i mitili esposti per 45 giorni nel sito impattato abbiano manifestato, rispetto al gruppo di controllo, un significativo incremento di attività enzimatica specifica.

L’elaborazione statistica dei dati con ANOVA a due vie (Tab.9) effettuata con GraphPad PRISM 6.0 considerando come fattori di variabilità il “sito di traslocazione” e il “periodo di traslocazione” ha evidenziato come il fattore “sito di traslocazione” risulti significativo, al contrario del “periodo di traslocazione”. Questo risultato dimostra come l’attività di anidrasi carbonica in ghiandola digestiva sia sensibile all’esposizione a inquinamento chimico ambientale. Tuttavia, come dimostrato dalla significatività dell’interazione tra i due fattori di variabilità (P=0.0303), la risposta dell’enzima all’esposizione ad inquinamento chimico ambientale è influenzata dal periodo stagionale in cui si effettua il campionamento. Infatti, come analizzato statisticamente mediante Bonferroni Test post test, l’incremento dell’attività di anidrasi carbonica nel sito esposto ad impatto antropico rispetto al sito di controllo risulta significativo (P<0.01 Bonferroni Test) solo nel periodo invernale, ma non in quello estivo corrispondente al periodo riproduttivo dell’animale.

Tabella 9. ANOVA a 2 vie eseguita sui dati relativi all’attività di AC specifica manifestata in

ghiandola digestiva dai mitili esposti nei siti di Brucoli e Rada di Augusta nel periodo invernale (time 1) ed estivo (time 2). S.S. = somma degli scarti al quadrato; D.F. = gradi di libertà; M.S. = media degli scarti al quadrato; P = probabilità.

3.3.1.4.2. ATTIVITA’ DI ANIDRASI CARBONICA NEL MANTELLO

In figura 25 è riportato l’andamento dell’attività di AC specifica di un campione di 48 tessuti di mantello prelevati da 12 organismi sentinella traslocati per 45 giorni nel sito di riferimento di Brucoli e nel sito ad impatto antropico Rada di Augusta nel corso della campagna di campionamento invernale (Time 1) condotta nei mesi dicembre 2013-gennaio 2014 e della campagna estiva (Time 2), condotta nel mese di luglio 2014.

L’attività di AC specifica è espressa come Unità Internazionali d’enzima (µmol di H+ sviluppate al minuto) per grammo di tessuto fresco. Le barre di errore rappresentano l’errore standard.

Sorgente di variabilità SS DF MS P value

Interazione 184314 1 184314 P = 0.0303

Periodo di traslocazione 2649 1 2649 P = 0.7896

Sito di traslocazione 216733 1 216733 P = 0.0194

Residuo (errore) 1618000 44 36776

E’ possibile osservare come i livelli di attività enzimatica misurati nel mantello dei mitili traslocati in Rada di Augusta abbiano manifestato, rispetto ai controlli, un andamento diverso nelle due campagne: nel periodo invernale (Time 1) è stato osservato un significativo incremento dei livelli di attività enzimatica, nel periodo estivo (Time 2) i dati hanno evidenziato un notevole incremento dei livelli basali rispetto al dato invernale osservabile nell’aumento dei livelli misurati nei mitili di controllo, a fronte di un’inibizione non significativa dell’attività enzimatica nei mitili esposti in Rada di Augusta.

Tim

e 1

Tim

e 2

Figura 25. Livelli di attività di AC specifica espressi come U internazionali d’enzima (µmol min-1)

x g-1 di tessuto fresco determinati nel mantello di M. galloprovincialis esposti nei siti di Brucoli e Rada di Augusta nella campagna invernale (time 1) ed estiva (time 2). I dati sono espressi come media ±E.S. di almeno 12 esemplari per ogni gruppo.

L’analisi statistica effettuata mediante two-way ANOVA ha restituito effetti significativi (P<0.0002) per il fattore di variabilità “periodo di campionamento”(tempo di campionamento) (Tab 10). Pertanto, la stagionalità sembra influire pesantemente sull’attività enzimatica di anidrasi carbonica del mantello, che in estate, in corrispondenza con il periodo riproduttivo, manifesta livelli basali significativamente incrementati anche negli organismi di controllo. Il fattore di variabilità “siti di traslocazione” non è risultato significativo, tuttavia l’interazione altamente significativa (P<0.0006) tra i due fattori di variabilità manifesta come l’incremento stagionale dell’attività di anidrasi carbonica nel mantello sia influenzato dall’esposizione ad inquinamento chimico.

Tabella 10. ANOVA a 2 vie eseguita sui dati relativi all’attività di AC specifica manifestata nel tessuto mantello dai mitili esposti nei siti Brucoli e Rada di Augusta nel periodo invernale (time 1) ed estivo (time 2). S.S. = somma degli scarti al quadrato; D.F. = gradi di libertà; M.S. = media degli scarti al quadrato; P = probabilità.

Infatti, l’analisi statistica mediante Bonferroni post test (P<0.01), conferma l’incremento significativo di attività nel sito esposto ad impatto antropico rispetto al sito di controllo nel periodo invernale.

3.3.1.4.3. ATTIVITA’ DI ANIDRASI CARBONICA NELLE BRANCHIE

In figura 26 è descritto l’andamento dei livelli di attività di AC specifica di un campione di 48 tessuti di branchie prelevati da 12 organismi sentinella traslocati per 45 giorni nel sito di riferimento di Brucoli e nel sito ad impatto antropico Rada di Augusta nel corso della campagna di campionamento invernale (Time 1) condotta nei mesi novembre-dicembre 2013, e della campagna estiva (Time 2) condotta nei mesi di giugno-luglio 2014.

Innanzitutto si osserva come l’attività di anidrasi carbonica in branchie sia mediamente più bassa rispetto a quella misurata in ghiandola digestiva e mantello.

Sorgente di variabilità SS DF MS P

Interazione 105882 1 105882 P = 0,0006

Tempo di campionamento 122008 1 122008 P = 0,0002

Siti di traslocazione 17123 1 17123 P = 0,1426

Tim e 1 Tim e 2 0 50 100 150 200

Attività di AC nelle branchie

U

d

i

A

C

x

g

d

i

p

e

s

o

f

re

s

c

o

Figura 26. Livelli di attività di AC specifica espressi come U internazionali d’enzima (µmol min-1)

x g-1 di tessuto fresco determinati nelle branchie di M. galloprovincialis esposti nei siti di Brucoli e Rada di Augusta nella campagna invernale (time 1) ed estiva (time 2). I dati sono espressi come media ±E.S. di 12 esemplari per ogni gruppo. Le barre d’errore rappresentano l’errore standard.

L’andamento registrato nei mitili esposti in Rada di Augusta è risultato mediamente costante attestandosi attorno a valori solo di poco inferiori nel Time 1 e superiori nel Time 2 alle attività enzimatiche riscontrate nei mitili di controllo.

Il trattamento statistico dei dati è stato effettuato mediante ANOVA a due vie, considerando come fattori di variabilità il sito di traslocazione e il periodo di campionamento. Come riportato in Tabella 11 non è stato rilevato alcun effetto significativo e non è stata rilevata alcuna interazione statisticamente significativa dei due fattori di variabilità considerati.

Tabella 11. ANOVA a 2 vie eseguita sui dati relativi all’attività di AC specifica manifestata nel

tessuto branchie dai mitili esposti nei siti di Brucoli e Rada di Augusta nel periodo invernale (time 1) ed estivo (time 2). S.S. = somma degli scarti al quadrato; D.F. = gradi di libertà; M.S. = media degli scarti al quadrato; P = probabilità.

Sorgente di variabilità SS DF MS P value

Interazione 4836 1 4836 P = 0,1109

Periodo di campionamento 166.5 1 166.5 P = 0,7641

Sito di traslocazione 1550 1 1550 P = 0,3619

Residuo (errore) 80379 44 1827

3.3.1.5. STUDIO DEL RUOLO FISIOLOGICO DI ANIDRASI CARBONICA IN