La valutazione dello stress ossidativo può essere effettuata sia prendendo in considerazione gli effetti indotti dalle specie ossidanti sulle biomolecole del corpo, sia sul sistema di difesa antiossidante. I valori maggiormente considerati per quanto riguarda i marker di stress ossidativo sono rappresentati da:
Metaboliti reattivi dell’ossigeno: ROOMS;
Perossidazione lipidica: acroleina, malondialdeide, 4- idrossinonenale, sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico, F2 isoprostano, ALE (Advanced Lipid oxidation End-products), anticorpi per LDL ossidate;
Ossidazione delle proteine: AOPP (Advanced Oxidation Protein Products);
Ossidazione dei glucidi: AGE (Advanced Glycation End- products);
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Per quanto concerne invece gli antiossidanti, possono essere valutati i seguenti marcatori:
Enzimatici: SOD, CAT, GPx;
Non enzimatici: Glutatione, Vitamina E, Vitamina C, ferritina, transferrina, albumina, acido urico, ecc.;
BAP: (Biological Antioxidant Potential);
ORAC: (Oxygen Radical Adsorbance Capacity);
TAC: (Total Antioxidant Capacity)
Nella clinica umana, i livelli di marker di ossidazione di lipidi, proteine e DNA sono notevolmente aumentati nei pazienti CKD, rispetto ai soggetti sani (Tab. 4). L’aumento della malondialdeide (MDA), un biomarker di ossidazione lipidica, è implicato nella grave glomerulosclerosi che si verifica nel corso della malattia (Kuo, H.T.2005). Altri studi (Grone, H.J.2002) hanno dimostrato che livelli di acido ipocloroso (HCIO), altro radicale spiccatamente reattivo, aumentano in maniera significativa nei podociti e nei glomeruli renali dei malati di CKD. Elevati livelli di 8- idrossi-2’-diidroguanosina sono associati a danno del DNA da ROS, nei soggetti affetti (Fujiwara, N.2011).
In particolare, secondo uno studio effettuato in medicina umana, da un confronto tra F2 isoprostano, MDA, rapporto glutatione ossidato/ridotto, AOPP e 8-idrossi-2’-deossiguanosina, quest’ultima risulterebbe il parametro più attendibile di danno ossidativo (Puchades M.J.2009).
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Livelli di geni codificanti per molecole antiossidanti, come SOD, CAT e GSH sono risultati d’altra parte ridotti nei pazienti CKD (Ceballos-Picot, I.1996; Ongajooth, L.1996; Shurtz-Swirski R.1995).
In letteratura esistono risultati contrastanti sul comportamento della barriera antiossidante enzimatica in corso di CKD. Alcuni studi, sia in ambito veterinario che nel campo della medicina umana (Zachara B 2003; Zachara B.2004; Kargin 2001; Lippi I.2011), si sono concentrati in particolare sull’andamento della GPx in relazione alla progressione dell’insufficienza renale. Come già affermato, le GPx sono una classe enzimatica di notevole importanza per la prevenzione della perossidazione lipidica. Sono state identificate una GPx plasmatica ed una eritrocitaria. Il principale sito per la sintesi di GPx plasmatica è rappresentato dal tubulo prossimale del rene (Avissar N.1994). Questo enzima è risultato significativamente ridotto nei pazienti renali umani e, per questo motivo, può essere considerato un fattore diagnostico e prognostico di CKD nell’uomo (Ceballos-Picot, I.1996; Zachara B et al.2006; Schiavon R.1994). La GPx eritrocitaria è presente negli eritrociti, nel rene e nel fegato. (Arthur JR.2005). Entrambe le componenti enzimatiche appaiono diminuite in un confronto tra le concentrazioni nei soggetti malati rispetto a quelle rilevate nei soggetti sani (Zachara BA et al.2004; Durak I.2007; Ongajooth L.1996). In contrasto con queste rilevazioni, è emerso da altre ricerche, che non esisterebbero invece differenze significative nell’attività della GPx eritrocitaria, tra soggetti affetti da insufficienza renale e soggetti sani (Zachara BA et al.2006; Zachara BA et al.2004). È stato valutato anche l’andamento della concentrazione dei due enzimi in relazione alla progressione dell’insufficienza renale, ed è emersa una riduzione, nella fasi iniziali della malattia, sia della componente plasmatica che
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eritrocitaria. Con l’aggravarsi dell’insufficienza renale, la GPx plasmatica è risultata in progressiva diminuzione, mentre la componente eritrocitaria ha mantenuto livelli stabili di concentrazione (Zachara B. et al. 2004; Zachara B.et al. 2001).
Come già premesso, la GPx esiste anche in una forma selenio- dipendente. In medicina umana è stato, pertanto, indagato il ruolo del selenio, in quanto costituente di selenio-proteine, che includono tra le altre le GPx e, nello specifico gli effetti di una carenza di questo sull’attività dell’enzima (Holben DH 1999). In base ai risultati di questi studi, nell’uomo affetto da CKD, una riduzione della funzionalità della GPx può essere imputata a: aumento della lipoperossidazione, diminuzione della massa renale funzionante (Ceballos-Picot I. 1996; El- far MA 2005; Zagrodzki P. 2001), interferenza delle tossine uremiche (El-far MA 2005; Zagrodzki P. 2001), consumo della GPx plasmatica, modificazioni biochimiche nella via dell’esoso-monofosfato (Zagrodzki P. 2001) ed anche deficienza di selenio, in quanto fattore limitante per la sintesi enzimatica. Uno studio sugli effetti della deficienza di selenio in relazione all’attività della GPx è stato effettuato anche in ambito veterinario, includendo nella valutazione gatti affetti da CKD a vari stadi di gravità (M. Kroficˇ Zˇ el N. 2014). Rispetto a quanto riscontrato nell’uomo, dove ad una carenza di selenio, da ridotta assunzione dietetica e aumentata perdita renale per la proteinuria (Allan CB 1999), corrisponde una ridotta funzionalità della GPx, nel gatto questo elemento non sembra essere un fattore limitante l’attività enzimatica. In questa specie, infatti, la concentrazione plasmatica di selenio è più alta rispetto alle altre specie (Foster DJ 2001) e la sua omeostasi è mantenuta grazie ad un’efficiente modulazione dell’escrezione renale di questo elemento (Todd SE A et al. 2012; Todd SE B et al. 2012). Sempre nel gatto è stato
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inoltre osservato che i sistemi antiossidanti enzimatici non si esauriscono con la progressione della CKD. Infatti, gatti con insufficienza renale ad uno stadio IRIS IV mostrano un aumento nell’attività della GPx plasmatica, probabilmente come meccanismo di risposta dell’organismo a concentrazioni crescenti di ROS. Non sono state riscontrate, invece, differenze significative per quanto riguarda la funzionalità della GPx eritrocitaria. Da questo stesso studio non sono state rilevate, inoltre, modificazioni dell’attività enzimatica, sia plasmatica che eritrocitaria, tra gli stadi IRIS I, II e III, come pure da un confronto tra questi soggetti e gatti sani (M. Kroficˇ Zˇ el. 2014). La funzionalità della GPx è stata indagata anche nel cane in CKD ed anche in questa specie è stato effettuato un confronto tra soggetti sani e malati (Kargin 2001) e, nell’ambito dei soggetti patologici, tra i diversi stadi IRIS della malattia. La concentrazione della GPx nel sangue intero di cani sani è risultata significativamente maggiore rispetto ai malati e, tra i 4 sottogruppi IRIS sono state identificate variazioni importanti tra un gruppo e l’altro. La GPx appare infatti fortemente diminuita nella fase iniziale della malattia (IRIS I); tende ad aumentare gradualmente nei soggetti classificati IRIS II, fino ad assestarsi a livelli sovrapponibili a quelli fisiologici nello stadio IRIS III e a superare i valori di riferimento nei soggetti inclusi nello stadio IRIS IV. L’aumento esponenziale della GPx, che va di pari passo con la progressione della CKD nel cane, trova concordanza anche con studi effettuati in campo umano (Mimic-Oka J. 1995). È possibile pensare che tale condizione si verifichi come risposta di tipo difensivo all’iperproduzione di radicali liberi nelle fasi finali della CKD. Oppure, può essere preso in considerazione l’effetto dell’integrazione alimentare di antiossidanti, che viene più frequentemente intrapresa a partire dagli
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stadi più avanzati della malattia, quando l’insufficienza d’organo si rende clinicamente evidente.
Tab. 4. Biomarkers di stress ossidativo e infiammazione nell’uomo con CKD
In aggiunta all’aumento dei markers di stress ossidativo occorre considerare che i soggetti con CKD sono costantemente esposti ad infezioni, malattie concomitanti di diversa natura e, per quanto riguarda i pazienti umani, stimolo infiammatorio della terapia dialitica. (Meuwese, C.L. 2011). Come risultato di questa condizione, sono stati osservati in medicina umana, notevoli aumenti nella concentrazione di citochine pro- infiammatorie, come il TNF-α e IL-1β in pazienti sottoposti a terapia emodialitica (Pereira B.J. 1994; Knight E.L. 2004; Meuwese C.L. 2001; Herbelin A. 1990), nonché aumento della proteina C-reattiva ed IL-6 rispetto ai soggetti sani (Shlipak M.G. 2003; Oberg B.P. 2004).
Si può concludere, pertanto, che lo stress ossidativo e l’infiammazione sono profondamente correlati, dal momento che un gran numero di radicali liberi è generato dai fagociti in risposta a stimoli infiammatori (Locatelli F. 2003). Inoltre, in corso di insufficienza renale cronica, la
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maggior produzione di molecole ossidanti, accompagnata o meno da una riduzione dell’attività delle molecole antiossidanti, determina stress ossidativo. Le ripercussioni che questo fenomeno può avere a livello sistemico, rendono i markers di stress ossidativo, dei parametri di cui è utile tenere conto ai fini di un’analisi della progressione della CKD e dell’esecuzione di una valutazione prognostica della malattia.
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Scopo della tesi
Con questo studio si intendono analizzare le correlazioni, eventualmente presenti, tra i diversi stadi di gravità dell’insufficienza renale cronica del cane e i livelli ematici dei principali antiossidanti enzimatici, al fine di indagare il comportamento della barriera antiossidante in relazione alla progressione della malattia. In particolare, abbiamo cercato di verificare, in primo luogo, se nel cane in corso di CKD siano presenti modificazioni significative nei livelli di SOD, CAT e GPx e se, tali alterazioni, possano essere messe in relazione con altri parametri, quali la creatininemia, la proteinuria, l’età ed il body condition score (BCS).
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