Biosaggi effettuati con olfattometro a flusso

Le molecole risultate attrattive nei confronti dei maschi durante i biosaggi svolti con olfattometro statico sono state successivamente testate utilizzando un olfattometro a flusso per confermare la loro capacità attrattiva. Gli estratti saggiati con questo strumento sono stati due: il metil miristato, acido grasso a quattordici atomi di carbonio prodotto nell’ampolla rettale femminile e il metil palpitato, acido grasso a sedici atomi di carbonio anch’esso prodotto nell’ampolla rettale femminile. L’arena (Figura 10) risultava costituita da una unità in plexiglas con dimensioni 20 cm di lunghezza, 19 cm di larghezza e 1,5 cm di spessore. Sul supporto e stata creata una camera circolare, dove veniva posizionato l’insetto all’inizio del test, collegata ad un corridoio lungo 9 cm e largo 1,5 cm che percorreva la zona centrale. Alla fine, il corridoio si presentava diramato in due corridoi più corti di lunghezza di 7,5 cm e larghezza di 1,5 cm. La superficie superiore e quella inferiore sono state coperte con due pannelli di vetro di grandezza uguale al supporto in plexiglas. I due corridoi della diramazione sono stati collegati ad un tubo di gomma estendibile, inserito in un meccanismo di areazione capace di mantenere separate le sostanze utilizzate nei biosaggi e garantire la circolazione dell’aria immessa nell’arena.

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Fig. 10 - Arena tipo Y-tube

Durante i test è stata fatta passare aria purificata e umidificata all’interno dei tubi in gomma ed è stata immessa nell’arena attraverso connessioni in teflon ad una portata di 1 mL/min. Utilizzando una struttura costituita da tubi in alluminio che formavano una solida

intelaiatura è stato possibile posizionare l’olfattometro orizzontalmente, sospeso da terra ad una altezza di 80 cm. L’intelaiatura è stata utilizzata anche per ancorare due lampade a luce fredda in posizione verticale, ad una altezza di 60 cm, sopra l’olfattometro. Gli individui sono stati introdotti nell’arena al centro della camera circolare presente all’estremità opposta della diramazione. La scelta doveva avvenire in un tempo massimo di tre minuti dopo il rilascio del maschio nell’arena e si considerava valida una risposta quando l’insetto percorreva tutto il corridoio centrale e si soffermava per più di 30 secondi in uno dei corridoi prodotti dalla diramazione terminale (Carpita et al., 2012). Gli insetti che non percorrevano il tratto centrale o che nell’arco della durata massima del biosaggio non si soffermavano per più di trenta secondi in uno dei due corridoi in prossimità della diramazione, producevano una risposta nulla che non veniva presa in considerazione. Le capacita attrattive delle molecole testate sono state saggiate su individui maschi con età

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compresa tra 10 e 15 giorni, utilizzando concentrazioni di uno e cinque femmine equivalenti con età di 21 giorni (Tabella 1). Per testare le molecole sono stati imbibiti dei tamponi costituiti da una porzione circolare di carta assorbente con diametro di 10 mm. Dopo circa 20 secondi, tempo necessario per permettere alla sostanza presente in eccesso sul tampone di evaporare, il tampone è stato inserito in un recipiente di vetro chiuso e collegato all’olfattometro con tubi di gomma. Lo stesso procedimento è stato eseguito per l’esano inserito nel secondo contenitore (controllo). Seguendo il metodo fornito da Ngumbi et al. (2012), dopo aver testato cinque individui, l’olfattometro è stato ruotato lungo l’asse orizzontale di 180° per evitare effetti dovuti alla posizione delle molecole. Dopo dieci individui si è provveduto alla pulizia del supporto seguendo il metodo descritto per l’olfattometro statico e le molecole sono state rinnovate. Per ogni molecola testata sono state acquisite 30 repliche ed ogni test ha previsto la sostituzione dell’individuo testato con un nuovo individuo coetaneo. I biosaggi sono stati effettuati durante il pomeriggio, dalle ore 15:30 alle ore 19:30, nei laboratori dell’Università di Pisa con temperature di 22° C±1 e umidità relativa al 45%±5.

Le scelte effettuate da B. oleae, durante i biosaggi con olfattometro statico e a flusso, sono state successivamente analizzate applicando il test del chi quadro con correzione di Yates per i piccoli campioni. Per la validità delle risposte è stato utilizzato un livello di probabilità P< 0,05.

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Tabella 1 - Sostanze individuate nelle ghiandole rettali di femmine vergini di B. oleae.

Composto Dose (ng)

1 f.e. 5 f.e.

etil decanoato, C10Et 8.45 42.25

metil dodecanoato, C12Me 13.64 68.20

etil dodecanoato, C12Et 32.42 162.10

metil tetradecanoato, C14Me 56.52 282.60

n-butil dodecanoato, C12Bun 8.08 40.40

etil tetradecanoato, C14Et 77.90 389.50

metil (Z)-9-esadecenoato, (9Z)-C16Me 21.00 105.00

metil esadecanoato, C16Me 74.55 372.75

etil esadecanoato, C16Et 87.19 435.95

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5. Risultati e discussione

I biosaggi in olfattometro statico hanno messo in evidenza la capacità attrattiva nei confronti dei maschi di due acidi grassi prodotti dalle ghiandole annesse all’ampolla rettale femminile. Durante gli esperimenti condotti è stato possibile evidenziare la capacità attrattiva del metil miristato (C14Me) e del metil palpitato (C16Me) (Figura 11). La

bioattività del metil miristato a concentrazioni di 1 equivalente femmina con 21 giorni di età si è espressa significativamente, su 40 risposte, con 26 scelte sulla molecola contro 14 risposte su esano (X2 = 4,225 e P = 0.039). Il metil palpitato è risultato attrattivo ad una concentrazione di 5 equivalenti femmina con 21 giorni di età e la capacita attrattiva del composto si è espressa, su 40 risposte, con 27 scelte sula molecola contro 13 scelte nei confronti dell’esano (X2

= 4.225 e P = 0.339).

Fig. 11 - Numero di scelte effettuate durante i test con olfattometro statico da maschi vergini di B. oleae nei confronti delle

sostanze estratte dalle ghiandole annesse all’ampolla rettale femminile e testate a dosi corrispondenti a 1 e 5 femmine equivalenti. L’asterisco indica valori statisticamente significativi.

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Le molecole risultate attrattive in olfattometro statico sono state successivamente saggiate utilizzando l’olfattometro a flusso. I biosaggi condotti con questo metodo hanno confermato solo il ruolo biologico attrattivo del metil palpitato (Figura 12) durante la comunicazione sessuale. Il test del chi quadrato, sulle risposte ottenute testando la molecola a 5 equivalenti femmina con età di 21 giorni, ha prodotto valori di X2 = 5.630 e P = 0.018. I biosaggi svolti con l’olfattometro a flusso non hanno confermato la capacità di attrazione nei confronti dei maschi del metil miristato che veniva messa in evidenza dai test effettuati con olfattometro statico.

I risultati emersi da indagini gas-cromatografiche su ampolle rettali hanno mostrato la presenza di nove composti biosintetizzati e la produzione di un ulteriore composto (etil oleato) presente anche nel maschio ma sintetizzata in maggiore quantità rispetto alle femmine. Le molecole estratte dalle ghiandole rettali confermano i risultati ottenuti con precedenti ricerche che individuano la presenza nell’ampolla rettale di composti come il metil dodecanoato (Mazomenos and Haniotakis 1981, 1985), l’etil tetradecanoato, il metil tetradecanoato, l’etil dodecanoato, il metil (Z)-9-esadecanoato, metil esadecanoato e l’etil esadecanoato (Gariboldi et al. 1983). Vengono quindi individuate per la prima volta tre

Fig. 12 - Numero di scelte effettuate durante i test con olfattometro a flusso da maschi vergini di B. oleae nei confronti delle

sostanze estratte dalle ghiandole annesse all’ampolla rettale femminile e saggiate a diverse concentrazioni, 1 e 5 femmine equivalenti. L’asterisco indica valori statisticamente significativi.

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nuove molecole la cui sintesi avviene nell’ampolla rettale di femmine con 21 giorni di età e che risultano esclusive della specie B. oleae, in quanto non sono mai state identificate in altri Tephritidae (Benelli et al., 2014; El-Sayed, 2014). Nella pubblicazione di Gariboldi et al. (1983) venivano identificati altri composti che non sono stati individuati nell’estratto delle ghiandole rettali di femmine vergini con 21 giorni di età. Per dare un esempio, possono essere elencate alcune molecole come: l’n-butil esadecanoato, l’n-butil esanoato, n-butil esadecenoato, l’etil esadecenoato, n-butil tetradecenoato, l’n-butil octadecenoato, l’etil octadecenoato ed il metil (Z)-9-octadecenoato. Le cause che hanno portato Gariboldi et al. (1983) a non identificare negli estratti ghiandolari le molecole sopracitate, possono essere attribuite ad una errata interpretazione delle analisi effettuate con lo spettrometro di massa oppure alla presenza di sostanze contaminanti nei campioni utilizzati. La produzione di tutti i composti estratti dalle ghiandole rettali risulta dipendente dall’età dell’insetto, aumenta sempre durante lo sviluppo e le concentrazioni di ogni composto, nelle femmine con età di 21 giorni, variano in un range che va da un minimo di 8.08 ng/individuo, per l’n-butil dodecanoato, ad un massimo di 87.19 ng/individuo raggiunto dalla molecola etil decanoato. Queste concentrazioni possono sembrare molto basse se paragonate alla quantità di olean prodotto dalle ghiandole annesse all’ampolla rettale delle femmine, ma possiamo comunque ipotizzare un eventuale ruolo biologico svolto dagli estratti, se pensiamo che il principale feromone maschile utilizzato durante la comunicazione sessuale, viene prodotto dalle ghiandole rettali ad una concentrazione di soli 50 ng/individuo (Canale et al., 2013b). Nel nostro studio, tutti i composti estratti dall’ampolla rettale sono stati testati prima utilizzando un olfattometro statico e successivamente sono state valutate con olfattometro a flusso le molecole risultate attrattive nei confronti dei maschi durante i test precedenti. I biosaggi effettuati seguendo questa procedura hanno identificato il metil palpitato come unico composto che risulta svolgere un ruolo attrattivo, a relativa lunga distanza, nei confronti dei maschi. La

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molecola manifesta una attività biologica dipendente dalla concentrazione, risultando attrattiva in quei biosaggi dove sono state usate concentrazioni di 5 equivalenti femmina. L’utilizzo di molecole che svolgono un azione biologica in funzione della concentrazione, risulta molto comune durante i processi di comunicazione sessuale condotti dagli individui appartenenti alla famiglia dei Tephritidae (Benelli et al., 2014). Per esempio, possiamo citare la sostanza conosciuta come (Z)-9-tricosene, la quale svolge un azione attrattiva nei confronti delle femmine solo quando vengono eseguiti test che comportano l’utilizzo di almeno 10 ghiandole estratte da maschi (Canale et al., 2013b). Lo stesso comportamento viene individuato durante i biosaggi svolti con la molecola ottenuta mediante processi di sintesi chimica. Il muscalure di origine sintetica risulta attrattivo nei confronti delle femmine in biosaggi che utilizzano concentrazioni di 1.5 o 3 equivalenti ghiandola rettale maschile (Carpita et al., 2012).

Con questa ricerca si sono potute chiarire alcune dinamiche che riguardano la bioattività e la produzione in funzione dell’età di alcuni composti sintetizzati dalle ghiandole rettali femminili coinvolti nei processi di comunicazione di B. oleae, aggiungendo informazioni importanti che permettono di capire meglio la chimica ecologica della riproduzione di questa specie. La molecola potrebbe essere utilizzata in strategie che mirano al controllo della mosca delle olive. A riguardo, la produzione di una sostanza attrattiva costituita da più molecole (blend), capaci di esercitare un azione sinergica attrattiva, potrebbe dare degli ottimi risultati se impiegata nelle strategie di monitoraggio, mass trapping e sistemi adulticidi utilizzati per controllare la popolazione del fitofago in pieno campo.

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BIBLIOGRAFIA

Benelli G, Canale A, Bonsignori G, Ragni G, Stefanini C, Raspi A, 2012 - Male wing

vibration in the mating behavior of the olive fruit fly Bactrocera oleae (Rossi) (Diptera: Tephritidae). – J. InsBehav 25:590–603

Benelli G, Canale A (2013) Do tephritid-induced fruit volatiles attract males of the fruit

flies parasitoid Psyttalia concolor (Szépligeti) (Hymenoptera: Braconidae) Chemoecology 23:191-199

Benelli G, Daane KM, Canale A, Niu CY, Messing RH, Vargas RI (2014) Sexual

communication and related behaviours in Tephritidae: current knowledge and potential applications for Integrated Pest Management. J Pest Sci doi:

10.1007/s10340-014-0577-3

Canale A, Carpita A, Conti B, Canovai R, Raspi A (2012) Effect of age on

1,7-dioxaspiro-[5.5]-undecane production in both sexes of olive fruit fly, Bactrocera oleae (Rossi) (Diptera Tephritidae). IOBC Bull 72:219–225

Canale A, Benelli G, Conti B, Lenzi G, Flamini G, Francini A, Cioni PL (2013a)

Ingestion toxicity of three Lamiaceae essential oils incorporated in protein baits against the olive fruit fly, Bactrocera oleae (Rossi) (Diptera Tephritidae). Nat Prod Res 27:2091-2099

Carpita A, Canale A, Benelli G, Conti B, Raspi A (2011) Componenti secondari presenti

nelle ghiandole associate all’ampolla rettale delle femmine di Bactrocera oleae (Rossi). XXIII Congresso Nazionale Italiano di Entomologia. Genova, Italy, 13–16 Giugno 2011, Atti p 169

Carpita A, Canale A, Raffaelli A, Saba A, Benelli G, Raspi A (2012) (Z)-9-tricosene

identified in rectal gland extracts of Bactrocera oleae males: first evidence of a male-produced female attractant in olive fruit fly. Naturwissenschaften 99:77-81

41

Cavalloro R, Delrio G (1970) Rilievi sul comportamento sessuale di Dacus oleae

(Gmelin) (Diptera, Tripetidae) in laboratorio. Redia LII:201–230

De Marzo L, Nuzzaci L, Solinas M (1978) Studio anatomico, istologico, ultrastrutturale e

fisiologico del retto ed osservazioni etologiche in relazione alla possibile produzione di feromoni sessuali nel maschio di Dacus oleae (Gmelin). Entomologica, XIV:203–266

Economopoulos AP, Gianakakis A, Tzanakakis ME, Voyatzoglou A (1971)

Reproductive behaviour and physiology of the olive fruit fly. 1. Anatomy of the adult rectum and odours emitted by adults. Ann Entomol Soc Am 64:1112–1116

Ferrari M., Marion E., Menta A. (2002) Fitopatologia, entomologia agraria e biologia

applicata. Calderini Edagricole

Fiorino P. (2007) Olea - trattato di olivicoltura. Edagricole

Gariboldi P, Verotta L, Fanelli R (1983) Studies on the sex pheromone of Dacus oleae.

Analysis of the substances contained in the rectal glands. Experientia 39:502-505

Gucci R, Caruso G, Canale A, Loni A, Raspi A, Urbani S, Taticchi A,Esposto S, Servili M (2012) Changes in free acidity, peroxide value and phenolic compounds

of olive oils obtained from fruits (cv. Frantoio) damaged by Bactrocera oleae (Rossi). Hort Science 47:301–306

Luigi Masutti, Sergio Zanghieri (2001) Entomologia generale e applicata. CEDAM :

740-743

Massimo Ricciolini (2010) Avversità dell’olivo e strategie di difesa in Toscana.

Arsia/Regione Toscana: 15-60

Mavraganis VG, Papadopoulos NT, Kouloussis NA, (2010) Extract of olive fruit fly

males (Diptera: Tephritidae) attract virgin females. Entomol Hell 19:14–20

Mazomenos BE (1989) Dacus oleae. In: Helle W Word Crop Pests (ed) Vol 3A: Fruit

Flies: their biology, natural enemies and control. p 169

42

Dacus oleae Gmelin: isolation and bioassay. J Chem Ecol 7:1561–1573

Mazomenos BE, Haniotakis GE (1985) Male olive fruit fly attraction to synthetic sex

pheromone components in laboratory and field tests. J Chem Ecol 11:397–405

Nino Iannotta, Tiziana Belfiore, Maria Elena Noce, Luigi Perri, Stefano Scalercio (2007) Effetti del trappolaggio massale sull’entomocenosi dell’ecosistema oliveto

nel controllo di Bactrocera oleae (Gmelin, 1970). Tudi Trent Sci Nat, Acta Biol., 83:83-84

Nino Iannotta, Tiziana Belfiore, Donatalla Monardo, Maria Elena Noce, Stefano Scalercio, Veronica Vizzarri (2007) Indagine nel germoplasma dell’olivo sul

comportamento di numerosi genotipi in relazione alla loro suscettibilità agli attacchi parassitari. Tudi Trent. Sci. Nat., Acta Biol., 83:215-220

Parlati M. V., Ianotta N., (1995) La qualità dell’olio in rapporto alla difesa da

Bactrocera oleae (Gmelin). Atti convegno “Tecniche, norme e qualità in olivicoltura”. Potenza, 15-17 dicembre 1993, pp. 445 458

Pucci c., (1991) Applicazione della tecnica dell’analisi canonica nella previsione

dell’infestazione dacica. M.A.F., convegno “Olivicoltura” Firenze 1991, ed. IST. Sper. Pat. Veg., Roma, pp. 49-61

Raspi A, Canale A, Lucchi A (1997) Preliminary observations on integumentary

urotergal glands in Bactrocera oleae (Gmelin) (Diptera Tephritidae). Frustula Entomol, 20:193–202

Raspi A., (1999) Applicazione di un modello revisionale di sviluppo per il controllo

integrato della mosca delle olive. Frustula entomologica, 22:36-46

Rossi R, Carpita A, Vita G (1978) (Z)-6-Nonen- l-ol and related compounds as attractants

of the olive fruit fly, Dacus oleae (Gmelin) (Diptera: Tephritidae). Gazz Chim Ital 108:709-712

Schultz CA, Boush GM (1971) Suspected sex pheromone glands in three economically

43

Viggiani G. (1993) la difesa integrata dell’agroecosistema olivo. INEA Zervas GA (1982) Reproductive physiology of Dacus oleae (Gmel.) (Diptera: