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Università di Pisa
Dipartimento di Scienze Agrarie Alimentari e Agro-ambientali
Corso di Laurea Magistrale in
Produzioni Agroalimentari e Gestione degli Agroecosistemi
Tesi di Laurea
Bactrocera oleae (Rossi):
bioattività nei confronti dei maschi di composti secondari
presenti nell’ampolla rettale femminile.
RELATORE CANDIDATO
Dr. Angelo Canale Francesco RapaliniCORRELATORE
Dr. Giovanni Benelli2
Indice
1.Premessa 3
1.1. Bactrocera oleae (Rossi) 3
1.1.1. Areale di distribuzione 4
1.1.2. Morfologia 5
1.1.3. Ciclo biologico 8
1.2. Danni 10
1.3. Soglie economiche di intervento 12
1.3.1. Metodi di monitoraggio degli adulti 13
1.3.2. Campionamento della popolazione preimmaginale 14
1.3.3. Modelli previsionali 14 2. Metodi di difesa 17 2.1. Lotta chimica 17 2.2. Lotta biologica 19 2.3. Lotta biotecnica 20 2.4. Lotta agronomica 21
2.5. Insetticidi di origine naturale 22
3. Ipotesi Sperimentale: attrattività di componenti secondari presenti nella ampolla rettale femminile 24 verso i maschi di B. oleae (Rossi).
3.1. Obiettivo della Tesi 27
4.Materiali e metodi 29
4.1. Allevamento in laboratorio di B. oleae 29
4.2. Biosaggi comportamentali 30
4.2.1. Biosaggi effettuati con olfattometro statico 31
4.2.2. Biosaggi effettuati con olfattometro a flusso 32
5. Risultati e discussione 36
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1. Premessa
In Toscana la coltivazione dell’olivo si estende su vaste aree del territorio occupando una superficie di oltre 70.000 ha. Questa attività agricola viene esercitata da 50.000 aziende ed è regolarmente praticata da un numero elevato di operatori part time e da operatori non professionali (Ricciolini, 2010). Le particolari condizioni climatiche presenti nel territorio, dalle zone collinari litoranee alle zone collinari più interne della regione, hanno stimolato nel tessuto sociale una particolare vocazione per questo tipo di attività agricola che si manifesta attraverso un paesaggio costituito principalmente dalla specie Olea europea L. La Toscana produce circa il 4-5% della produzione nazionale di olio e commercializza un prodotto che si differenzia per le caratteristiche qualitative uniche e fortemente legate al territorio. Il fitofago chiave dell’agroecosistema oliveto nei territori olivicoli del Mediterraneo è rappresentato dalla mosca delle olive (Bactrocera oleae (Rossi)). Le infestazioni generate dalla mosca variano in funzione delle caratteristiche climatiche ed ambientali, distribuendosi sul territorio nazionale in modo non uniforme. In annate favorevoli allo sviluppo del fitofago si possono verificare ingenti danni economici dovuti principalmente a una elevata cascola delle drupe e alla produzione di olio con scarse caratteristiche qualitative
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Tra i metodi di controllo a basso impatto ambientale, la confusione sessuale rappresenta una strategia di controllo sostanzialmente priva di effetti negativi verso l’ambiente e le specie non target. Ulteriori e più mirati studi sono necessari per la messa a punto di tale metodo di lotta nei confronti della mosca delle olive. In particolare, è necessario definire il ruolo delle sostanze secondari presenti nell’ampolla rettale femminile.1.1 Bactrocera oleae (Rossi)
La famiglia dei Tephritidae è costituita da oltre 4000 specie, tra cui molti fitofagi di grandissimo interesse agrario. I Tephritidi sono ditteri di modeste dimensioni, con ali
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spesso macchiate di bruno o grigio, occhi composti iridescenti, capo con antenne brevi e apparato boccale succhiatore. Le femmine sono provviste di un ovopositore di sostituzione che garantisce una deposizione dell’uovo all’interno di tessuti vegetali come frutti, foglie ed infiorescenze. Nelle specie carpofaghe di tefritidi esistono due tipi di ciclo biologico. Il primo comprende specie plurivoltine, generalmente polifaghe, dal ciclo continuo in condizioni climatiche favorevoli (omodiname) e caratterizzato da una spiccata longevità degli adulti in caso di svernamento come, nei generi Ceratitis e Bactrocera; il secondo raggruppa specie univoltine, monofaghe o quasi, con adulti caratterizzati da un lungo stadio preimmaginale quiescente (eterodiname) come gli individui appartenenti al genere
Rhagoletis (Masutti e Zangheri, 2001). La famiglia dei tefritidi, secondo alcuni autori,
viene suddivisa in tre sottofamiglie: Dacinae, Trypetinae e Tephritinae (Drew, 1989).
B. oleae è un dittero tefritide facente parte della sottofamiglia Dacinae. A questa
sottofamiglia appartengono due generi molto simili, ma differenziati principalmente in funzione delle caratteristiche morfologiche e delle piante ospiti di cui si nutrono le larve. Il genere Dacus è costituito da individui che si caratterizzano per avere l’addome con il III e IV urotergite fusi insieme e comprende specie quasi tutte africane che vivono a spese di Asclepiadacee e Cucurbitacee. Il genere Bactrocera comprende individui con addome costituito da urotergiti liberi e da specie carpofaghe, come B. oleae che rappresenta l’unica specie di questo genere nel bacino del mediterraneo.
1.1.1 Areale di distribuzione
B. oleae ha un areale di distribuzione che comprende prevalentemente le regioni
circummediterranee, estendendosi a oriente fino al Caucaso ed al Pakistan, ed a occidente fino alle Isole Canarie. Risulta presente anche in Africa del Sud, in Asia centrale nella zona del Mar Nero, in India e in Messico nella regione della Baja California. In Italia la mosca delle olive si trova in tutte le regioni in cui viene coltivato l’olivo e rappresenta il fitofago chiave di questa coltura. La diffusione e la dannosità del dittero risultano non
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Fig. 1 - Maschio di B. oleae
omogenee sul territorio Toscano. Gli oliveti situati nell’area litoranea sono soggetti a puntuali e consistenti attacchi di B. oleae, mentre nelle aree olivicole interne l’insetto compie un numero di generazioni inferiori, generando danni minori che solo in annate particolari può determinare danni economici consistenti (Ricciolini, 2010).
1.1.2 Morfologia
Gli adulti di B. oleae hanno dimensioni di 4-5 millimetri di lunghezza e 11-12 millimetri di larghezza ad ali distese. Il capo è di colore giallo fulvo, porta un paio di antenne brevi color bruno, una proboscide bruna, palpi bruni ed occhi verde metallico. Il torace presenta una colorazione giallo-rossa e dorsalmente manifesta una pigmentazione di colore grigio con tre linee longitudinali più scure. Le pleure mesotoraciche hanno una colorazione castano chiaro provvista di macchie di colore avorio in prossimità del callo omerale, delle aree mesopleurali e metapleurali. Lo scutello mesotoracico porta due grosse setole e si caratterizza per la presenza di una grossa macchia centrale di colore avorio. Il metanoto, il postscutello ed una parte degli sterniti sono di colore nero. Le ali sono ialine e iridescenti. Le nervature, la parte apicale dello stigma e una piccola area diffusa all’apice sono di colore bruno. L’addome è di colore fulvo con due grosse macchie nere laterali di grandezza variabile sui primi quattro urotergiti. Nei maschi (Figura 1) assume una forma più rotondeggiante, mentre nelle femmine (Figura 2) si presenta più o meno romboidale e porta alla base un ovopositore sclerificato, a forma di lancetta, di colore nerastro e lungo circa 1 millimetro. I maschi sono leggermente più piccoli delle femmine.
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L’uovo ha una forma affusolata, poli arrotondati e micropilo tubercoliforme. Le sue dimensioni risultano circa 0,8 millimetri di lunghezza e 0,2 millimetri di diametro. Il tessuto più esterno (corion) è di colore bianco madreperlaceo, provvisto di una reticolatura poligonale molto fine, data dall’impronta delle cellule follicolari.
Prima di differenziare il pupario la larva compie un ciclo di sviluppo di tre stadi larvali, ognuno distinguibile per la forma, per la dimensione dell’armatura boccale e per la presenza o meno di stigmi toracici. La larva di prima età (Figura 3) ha una lunghezza di circa 1-2 millimetri, risulta quasi trasparente alla nascita e acquista un colore
bianco-giallastro nei successivi giorni di vita. Il capo è costituito da un apparato cefalo-faringeo di I tipo, poco sclerificato e terminante con un uncino apicale. Sull’addome sono presenti un paio di stigmi posizionati sull’ultimo segmento addominale (larve metapneustiche). La larva di seconda età assume una forma cilindrica di lunghezza di circa 3-4 millimetri. L’apparato boccale risulta più sclerificato rispetto a quello della larva di prima età, ma rimane comunque poco sviluppato. Sull’addome sono presenti un paio di stigmi sull’ultimo segmento addominale e un paio di stigmi protoracici (larve anfipneustiche). La larva di terza età (Figura 4) ha una colorazione bianco-giallastra ed assume una forma conica
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allungata. L’estremità anteriore è appuntita mentre l’estremità posteriore risulta rotondeggiante. Il capo ridotto ad un apparato cefalo faringeo, porta un paio di antenne minuscole costituite da tre segmenti ed un’armatura boccale molto più complessa rispetto alle larve di prima e seconda età. I primi segmenti del corpo portano delle spinule sia dorsalmente che ventralmente. Dal quinto al dodicesimo segmento le larve sono provviste, solo sulla parte ventrale, di protuberanze coperte da spinule utilizzate per la locomozione. L’età larvale può essere individuata in funzione della dislocazione e forma degli stigmi respiratori. Nelle larve di prima età l’apparato respiratorio è costituito da un paio di stigmi posizionati sull’ultimo segmento addominale, mentre nelle larve di seconda e terza età è provvisto di un ulteriore paio di stigmi protoracici. La pupa ha una forma ellittica ed una colorazione che varia dal bianco crema al giallo ocra. Le sue dimensioni variano, in funzione del tipo di alimentazione della larva, da 3,5 millimetri di lunghezza per 1,4 millimetri di diametro a 4,5 millimetri di lunghezza per 2 millimetri di diametro.
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1.1.3 Ciclo biologico
B. oleae si trova in tutti gli areali di coltivazione dell’olivo localizzati nel bacino del
Mediterraneo, con variazioni di densità della popolazione e del ciclo biologico che risultano fortemente legate alle condizioni macro e microclimatiche della zona presa in esame. In generale, la fenologia della mosca appare differenziata secondo i gradienti climatici relativi alla latitudine e all’altitudine, manifestando un interruzione del ciclo biologico in inverno al Nord, in inverno ed estate al Centro e solo nel periodo estivo al Sud (Ricciolini, 2010). Risulta quindi difficile individuare un unico quadro biologico della mosca, essendo essa capace di modellare il proprio ciclo in funzione delle condizioni climatiche e trofiche. In generale, dopo 4-6 giorni dall’accoppiamento la femmina inizia la ricerca di olive adatte all’ovideposizione servendosi di stimoli visivi e chimici. Dopo aver individuato il frutto idoneo alla ovideposizione, la femmina provvede alla formazione di una camera sottoepidermica utilizzando l’ovopositore. Durante questa operazione, utilizza l’apparato boccale per aspirare i succhi cellulari emergenti dalla ferita, i quali vengono presumibilmente rigurgitati per marcare la drupa. L’attività repellente dei composti prodotti con la marcatura risulta attiva per circa 2-3 giorni, dopodiché, in condizioni di elevata infestazione e scarsità di frutti, altre femmine di B. oleae possono scegliere la stessa drupa per depositarvi l’uovo. La ferita causata dall’introduzione dell’uovo nella drupa si presenta di forma triangolare e dopo due giorni acquista un colore brunastro. Le ovideposizioni, di norma, avvengono nei frutticini a partire da giugno fino a luglio, momento in cui si manifesta la fase fenologica di indurimento del nocciolo. Ogni femmina depone circa 200-250 uova (Ferrari, 2002), deponendo un uovo per frutto. L’uovo deposto, a seconda delle condizioni climatiche, passa un periodo di incubazione che varia tra 2-4 giorni in estate, 10 giorni in autunno e 12-19 giorni nel tardo autunno. La soglia termica inferiore per l’uovo è stimata intorno a 6 °C. Dopo aver passato il periodo di incubazione l’uovo schiude ed avviene la fuoriuscita della larva. Questa inizia a nutrirsi scavando
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gallerie nel mesocarpo, di diametro sempre più grande con l’aumentare delle dimensioni della larva. Raggiunta la maturità, la larva predispone una camera a ridosso dell’esocarpo e pratica un foro d’uscita nel caso in cui dovesse impuparsi dentro la drupa. Nei mesi estivi il ciclo completo da uovo ad adulto si svolge in circa 3 settimane. Il numero di generazioni che compie la mosca varia a seconda delle condizioni climatiche. Nelle regioni più fresche
B. oleae compie 2-3 generazioni, mentre in quelle più miti si possono raggiungere anche
6-7 generazioni (Ferrari, 2002). Durante i mesi più caldi si può manifestare l’arresto delle ovideposizioni che riprendono in tarda estate-autunno.
In Toscana, passando dalle zone litoranee a quelle appenniniche, si possono rilevare notevoli differenze del ciclo biologico e del numero di generazioni (Ricciolini, 2010). Se consideriamo la provenienza degli adulti che danno origine alle prime infestazioni estive, possiamo individuare:
Adulti sfarfallati in marzo-aprile che superato il “periodo bianco”, momento durante il quale non sono presenti drupe per l’ovideposizione, ritornano nell’oliveto per ricercare olive idonee alla ovideposizione.
Individui svernati come immagine, sfarfallati durante l’autunno precedente.
Adulti provenienti da una generazione primaverile sviluppatasi su olive rimaste sulla pianta dall’anno precedente.
In Toscana gli adulti sono presenti tutto l’anno, ma la loro presenza nell’oliveto si manifesta principalmente da metà marzo a metà aprile e, dopo il periodo bianco, da luglio, momento in cui la drupa si trova nella fase di indurimento del nocciolo (Figura 5). Le uova si possono trovare durante il periodo che va da luglio a tutto ottobre, fino a quando viene raggiunta la soglia termica di riproduzione che si manifesta con temperature medie al di sotto dei 13-14 °C. Le larve sono principalmente presenti da luglio fino a novembre, mentre le pupe si possono trovare da metà luglio fino a marzo-aprile.
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1.2 Danni
La mosca delle olive può costituire un serio problema sia in oliveti destinati alla produzione di olive da tavola sia in oliveti destinati alla produzione di olio. Sulle olive da tavola, B. oleae può dare origine a danni economici mediante la sola ferita causata dalla perforazione dell’epicarpo con l’ovopositore. Sulle olive destinate alla produzione di olio si possono evidenziare tre principali tipi di danno: perdita di polpa (mesocarpo) nella drupa dovuta all’attività trofica della larva, cascola delle olive attaccate, alterazioni qualitative dell’oliva con forti ripercussioni sulle successive caratteristiche qualitative dell’olio prodotto.
Il danno provocato dall’asportazione di una parte della polpa risulta di entità relativamente modesta, considerando che la perdita costituisce il 3-5% sul peso fresco. L’entità del danno può diventare più rilevante per frutti di dimensioni molto piccole (es. Moraiolo, Maurino, Taggiasca e Mignola) con asportazioni che possono raggiungere il 20% sul peso fresco.
L’attività trofica della larva stimola all’interno della drupa la produzione di ormoni e sostanze capaci di indurre una precoce caduta dei frutti (cascola). Questa particolare condizione si manifesta attraverso una precoce induzione alla maturazione e con un’alterazione della forza con cui la drupa si attacca al picciolo. Tale forza, in funzione
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dello sviluppo della larva, diminuisce del 10-40% rispetto a quella delle olive sane (Ricciolini, 2010). Le condizioni che portano al distacco delle olive vengono stimolate ulteriormente dopo la creazione del foro di uscita da parte della larva matura. La cascola costituisce uno dei principali danni causati dalla mosca, in quanto può interessare una buona parte della produzione.
L’olio prodotto con olive infestate da B. oleae manifesta alterazioni qualitative sotto il profilo chimico ed organolettico/sensoriale. Le alterazioni più evidenti avvengono sul contenuto di acido oleico (Gucci et al., 2012), sul numero di perossidi, sul contenuto in polifenoli e sulla qualità delle sostanze volatili. L’idrolisi enzimatica dei trigliceridi che costituiscono circa il 98% dell’olio da origine ad un aumento del grado di acidità, trasformando i trigliceridi in acidi grassi. Questo processo enzimatico viene stimolato dall’ossigeno presente nell’aria che tramite il foro di uscita entra in contatto con la polpa e le sostanze grasse contenute nel frutto. Risulta evidente il rapporto che intercorre tra l’entità dell’infestazione e l’aumento del contenuto di acido oleico nell’olio prodotto, anche se non tutti i tipi di infestazione hanno la stessa incidenza. La presenza di larve nella drupa nei primi stadi preimmaginali non incide notevolmente sul grado di acidità. Risulta più legata all’aumento di acidità la presenza di larve mature, pupe e gallerie abbandonate e, soprattutto, i sopra menzionati fori d’uscita. In modo analogo al grado di acidità anche il numero di perossidi, che esprime il grado di ossidazione delle sostanze grasse, tende ad aumentare con olive infestate dalla mosca. La frazione insaponificabile dell’olio espressa dai polifenoli tende ad essere alterata nell’olio prodotto con olive infestate. La causa della riduzione del contenuti in polifenoli può essere attribuita all’utilizzo di queste sostanze da parte della pianta per contrastare i numerosi processi ossidativi che si manifestano nelle drupe attaccate dalla mosca. Un altro parametro utilizzato per definire la qualità dell’olio è il contenuto di determinati composti volatili. Questo parametro risulta molto sensibile e può essere alterato anche con infestazioni di modesta entità. La presenza di larve nella
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drupa porta alla comparsa di difetti percettibili nell’olio attraverso analisi sensoriali gustative e olfattive. Inoltre recentemente è stato introdotto il difetto di “larva” nelle schede utilizzate durante i test per definire la qualità organolettica/sensoriale dell’olio. L’alterazione dei parametri che individuano la qualità dell’olio possono costituire un danno economico molto importante. Il contenuto di acido oleico, il numero di perossidi e l’analisi organolettica olfattiva e gustativa sono parametri che vengono utilizzati per individuare la denominazione di vendita di un olio. Ad esempio, la presenza di difetti che riguardano il profilo organolettico/sensoriale permette di classificare un olio come “olio vergine di oliva”, generando una forte riduzione del valore commerciale del prodotto ottenuto.
1.3 Soglie economiche di intervento
L’applicazione di interventi di difesa è strettamente legata alle perdite dirette e indirette causate dall’attività del fitofago. Le regole di “lotta integrata” prevedono che l’intervento fitosanitario sia giustificato solo se la densità di popolazione dell’insetto, durante la sua evoluzione, costituisce realmente una causa di alterazione del processo produttivo capace di generare una perdita economica superiore al costo del trattamento. La lotta integrata prevede tre tipi di soglia economica: la soglia economica di tolleranza, di danno e di intervento. La soglia di intervento viene raggiunta quando la densità di popolazione del fitofago acquista valori ritenuti convenienti per effettuare l’intervento di difesa, al fine di evitare un danno economico. La stima viene effettuata mediante l’esame di 100-200 drupe per appezzamento omogeneo, prelevate in misura di 1-3 per pianta. La soglia di intervento più utilizzata per giustificare un trattamento preventivo adulticida con esche proteiche contro B. oleae, risulta essere il 2-3% di olive infestate da uova e larve di prima età. La soglia di intervento utilizzata per applicare un trattamento di difesa curativo larvicida viene raggiunta con il 7-14% di olive infestate da uova, larve di I età e larve di II età. Bisogna aggiungere che la dannosità potenziale di una stessa popolazione di mosca, durante il periodo che va dalla fase di indurimento del nocciolo alla maturazione delle olive, varia in
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funzione dell’incidenza dei fattori biotici e abiotici di limitazione e della distanza temporale dalla raccolta. In Toscana il momento in cui si manifesta la massima dannosità potenziale è generalmente la seconda decade di settembre.
1.3.1 Metodi di monitoraggio degli adulti
L’utilizzo di trappole per la cattura degli adulti è una tecnica che permette di razionalizzare gli interventi di difesa contro B. oleae. I prodotti utilizzati si differenziano in funzione delle loro caratteristiche attrattive generalmente distinte in strutturali (forma e dimensioni) e di richiamo (visivi e olfattivi). Gli adulti di B. oleae sono attratti da trappole di colore giallo con forma sferoidale, caratteristica attrattiva che richiama la forma del frutto. Questo tipo di trappola risulta essere la più efficace per capacità attrattiva e selettiva. I prodotti che esercitano un azione di richiamo olfattiva utilizzano composti chimici attrattivi come i sali di ammonio, le proteine idrolizzate, le sostanze volatili della pianta ospite e i feromoni sessuali. I sali di ammonio e le proteine idrolizzate vengono definiti come attrattivi alimentari e si basano sul medesimo principio di azione. Queste sostanze esercitano una attrazione chimica efficace nei confronti delle femmine, mentre le trappole innescate con il feromone sessuale femminile sono attrattive nei confronti dei maschi. Per aumentare l’efficacia della trappola si possono trovare in commercio prodotti che utilizzano più fattori attrattivi. Le trappole multiattrattive utilizzate per il monitoraggio della mosca delle olive sono di colore giallo, munite di un erogatore a lento rilascio di ammoniaca e provviste di un dispenser di feromoni sessuali. Il monitoraggio degli adulti può essere utilizzato per stimare la variazione di densità relativa della popolazione nel tempo. In questo caso, la capacità massima di cattura della trappola costituisce un fattore secondario rispetto alla uniformità nel tempo del potere di cattura e una corretta gestione delle trappole. Per ottenere dati affidabili si devono effettuare controlli con frequenza settimanale. Durante il monitoraggio degli adulti vengono utilizzate da 1 a 3 trappole per ettaro, cercando di
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posizionarle preferibilmente sul terzo superiore della chioma esposta a Sud o a Ovest nel periodo di fine giugno.
1.3.2 Campionamento della popolazione preimmaginale
La stima della popolazione preimmaginale può essere calcolata con metodi di campionamento di tipo diretto. In sintesi, essi consistono nel prelevare 100 drupe/ha, casualmente ed una per pianta, e nell’osservare allo stereomicroscopio gli stadi in esse presenti. La soglia economica di intervento sarà verificata attraverso il calcolo della infestazione attiva, data dalla somma delle uova, larve di I e II età rilevate nel campione di olive.
1.3.3 Modelli previsionali
Lo studio approfondito dell’ecologia e delle dinamiche di popolazione, viene utilizzato per produrre modelli previsionale della densità di popolazione che consentano di limitare al minimo le operazioni di lotta con insetticidi. Questo obiettivo viene raggiunto con la definizione di appropriati metodi atti a valutare la densità di popolazione, i momenti in cui si realizzano, la maturità sessuale in rapporto alla recettività delle drupe, nonché i danni conseguenti che B. oleae è in grado di infliggere alla produzione (Parlati e Iannotta, 1995). I modelli di previsione utilizzati per individuare le soglie di intervento nei riguardi della mosca dell’olivo sono principalmente due: uno basato sulla fenologia dell’insetto e l’altro riferito alla sua dinamica di popolazione. Il primo tipo fornisce informazioni sulle fasi fenologiche e sul tasso di sviluppo nel corso della stagione produttiva in rapporto alle condizioni termiche ambientali (metodo della somma Termica) (Raspi, 1999). Il secondo tipo di modello utilizza trappole cromotropiche per stimare la densità di popolazione delle femmine allo scopo di prevedere il livello e la gravità di infestazione. Entrambi i modelli utilizzano un metodo di statistica applicata noto con il nome di “analisi canonica” che prevede di determinare coppie di combinazioni lineari di due gruppi di variabili che abbiano il più elevato valore di correlazione (Pucci et al., 2005). Le variabili predittive
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vengono rilevate con il numero di maschi (medio/trappola) catturati durante il periodo di sette giorni ed il valore medio di alcuni parametri climatici (temperatura, umidità relativa e piovosità) registrati nella stessa settimana. I modelli previsionali possono essere elaborati utilizzando sia il numero di femmine catturate sia il numero di maschi catturati. Per la cattura delle femmine si impiegano trappole cromotropiche e le variabili che risultano più strettamente correlate sono:
il numero di femmine rilevato ad una certa data e la temperatura media registrata durante la settimana di cattura (Z) .
il numero di femmine catturate e l’infestazione distinta in: uova+larve di prima età, larve di prima età + larve di II età, pupari + pupari vuoti + gallerie abbandonate e cascola
il valore Z ci permette di stabilire il momento in cui bisogna intervenire con un metodo di lotta basandosi sul numero di femmine catturate per trappola e la temperatura media rilevata durante il periodo di cattura. Questa variabile viene generalmente calcolata nel periodo di tempo che va dalla fase di indurimento del nocciolo alla prima decade di ottobre. Se vogliamo calcolare Z ad una certa data di suddetto periodo occorre applicare la formula:
Z = 0,039 (Fm – 9,7) – 0,186 (Tm – 22,1)
Dove Fm è il numero medio di femmine/trappola/settimana e Tm è la temperatura media registrata nella settimana di cattura. In questo caso è stato stimato che l’intervento di difesa risulta essere giustificato solo se la variabile Z supera il valore di Z=0,10. Questo modello di previsione dell’infestazione è stato messo a punto nell’ambiente olivicolo dell’Italia centrale (Pucci, 1991) ma, pur mostrandosi un valido strumento per il controllo guidato su
B. oleae, presenta alcuni limiti come: una scarsa selettività delle catture che incide sul
complesso dell’entomofauna utile, la difficoltà per l’agricoltore nel distinguere agevolmente e conteggiare i due sessi e la tempestività con cui l’intervento deve essere
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eseguito una volta superata la soglia di intervento. La formulazione di modelli previsionali basata sulle catture dei maschi effettuate con trappole innescate dal feromone sessuale femminile si dimostra da un lato altamente selettiva, dall’altro limitata dalla cattura di soli maschi non direttamente correlabili con l’infestazione. Il numero di trappole da utilizzare per il monitoraggio varia da 1- 3/ha in funzione di alcune variabili (numero delle cultivar presenti, omogeneità dell’oliveto, produttività, ecc.) e devono essere distribuite a metà della chioma con esposizione verso Sud. Nel caso dei maschi, se vogliamo calcolare il valore di Z, è necessario utilizzare l’espressione:
Z = 0,027 Mm – 0,399 Tm + 0,871
Dove Mn è il numero medio di maschi catturati settimanalmente impiegando trappole innescate con il feromone sessuale femminile e Tm è la temperatura media registrata durante il periodo di cattura degli adulti. In questo caso la soglia di intervento è stata stimata con un valore di Z=-1. La soglia di intervento nel modello di previsione basato sulla cattura dei maschi viene raggiunta con due settimane di anticipo rispetto al modello che prevede la cattura delle femmine. Questa condizione consente di intervenire con trattamenti preventivi a base di composti adulticida.
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2. Metodi di difesa
Le strategie di difesa utilizzate per combattere la mosca delle olive possono essere distinte in: chimiche, biologiche, biotecniche e agronomiche.
2.1 Lotta chimica
Tra i metodi di difesa chimica si possono individuare principalmente due strategie di intervento: preventiva e curativa. Il trattamento preventivo ha come obiettivo la riduzione della popolazione degli adulti (adulticida) basandosi sulla distribuzione di esche proteiche avvelenate a partire dal momento in cui diventa reale il rischio di infestazione. Per questo tipo di intervento si possono utilizzare esche proteiche che contengono 1% di proteine idrolizzate e lo 0,06-0,12% di insetticida (dimetoato, deltametrina) oppure esche proteiche già avvelenate con spinosad da utilizzare in miscela con acqua al 20%. Il trattamento con dimetoato viene effettuato distribuendo la miscela, in misura di 0,3-1,2 litri per pianta, su un settore della chioma di tutte le piante dell’oliveto, oppure, in misura superiore, su tutta la chioma di un numero ridotto di piante. Per il trattamento con spinosad viene consigliata una distribuzione localizzata a spot su piante alterne, utilizzando 5 litri di miscela per ettaro. Le esche proteiche sono composti chimici che manifestano una modesta persistenza, risultano sensibili alla luce e facilmente dilavabili. Queste caratteristiche rendono il trattamento dipendente dalle condizioni climatiche che si vengono a verificare e più oneroso, dovendo intervenire con un numero di applicazioni maggiore rispetto al trattamento curativo larvicida. Si considera che, a parità di condizioni, fra i due metodi vi sia un rapporto di 2 o 3 a 1 nel numero di interventi per stagione (Ricciolini, 2010). La lotta adulticida deve seguire i principi di lotta integrata che giustificano il trattamento solo se vengono raggiunte le soglie di intervento o comunque di rischio, almeno per il primo trattamento. La soglia utilizzata in Italia centrale per giustificare l’intervento adulticida viene raggiunta con livelli del 2-3% di olive infestate da uova e larve di prima età, cui in
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genere corrisponde un valore di catture pari a 4-5 femmine per trappola cromotropica per settimana. La difesa preventiva risulta efficace nelle aree dove si manifestano scarse precipitazioni nel periodo estivo autunnale e caratteristiche climatiche che limitano la densità di popolazione degli adulti. Nelle zone più interne della Toscana spesso i livelli di popolazione adulta non costituiscono un rischio economico e gli attacchi si manifestano quasi sempre in settembre-ottobre, favorendo l’adozione di metodi di lotta adulticida. Le aree olivicole lungo la costa manifestano condizioni climatiche più favorevoli allo sviluppo di B. oleae. In queste zone la densità di popolazione raggiunge livelli talmente elevati, sopratutto nel mese di settembre, da rendere inefficace il controllo con metodi di lotta adulticida. Per la difesa delle aree olivicole costiere si possono adottare interventi combinati che prevedono l’applicazione di un trattamento larvicida, finalizzato a ridurre la successiva popolazione adulta nei mesi di luglio-agosto e di trattamenti adulticidi con esche proteiche a partire dal mese di settembre. La difesa preventiva produce dei buoni risultati solo se applicata su vaste aree olivicole.
Gli interventi curativi vengono utilizzati per ridurre la presenza dell’insetto nei suoi stadi preimmaginali, in particolare contro uova e larve di I età. La difesa curativa si effettua applicando miscele insetticide su tutta la chioma delle piante costituenti l’oliveto quando viene raggiunta la soglia di intervento stabilita. Per il trattamento larvicida vengono utilizzati principi attivi che manifestano una buona penetrazione nella polpa del frutto. Gli insetticidi impiegati devono avere una buona citotropicità, per raggiungere meglio il bersaglio, e una elevata idrosolubilità, per limitare contaminazioni dovute alla presenza di residui nell’olio. I più utilizzati sono alcuni fosforganici endoterapici. Il trattamento larvicida risulta più facile da gestire, rispetto al trattamento con esche proteiche, in quanto la principale variabile da tenere sotto controllo è il livello di infestazione. Viene preferito dagli olivicoltori per alcuni pregi come una elevata capacità di adattamento alle diverse situazioni e una buona flessibilità nei tempi di intervento, risultando un metodo valido e
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difficilmente sostituibile in zone dove i livelli di infestazione variano notevolmente da un anno all’altro. Le soglie di intervento che giustificano l’applicazione del trattamento larvicida variano, in funzione della cultivar, della produzione e della distanza dall’epoca di raccolta, dal 7% al 14% di drupe infestate da uova, larve di I età e larve di II età (infestazione attiva). In Toscana il periodo che va dai primi di settembre ai primi di ottobre costituisce il momento più critico per lo sviluppo dell’infestazione e il suo controllo.
2.2 Lotta biologica
La lotta biologica può essere attuata favorendo la naturale diffusione di parassitoidi di B.
oleae. Fra gli antagonisti utili nel bacino del mediterraneo, si possono ricordare gli
imenotteri calcidoidei ectofagi Eupelmus urozonus (Dalman), Pnigalio mediterraneus (Ferrière e Delucchi), Euritoma martellii (Domenichini), il dittero cecidomide
Prolasioptera berlesiana (Paoli) ed il braconide endofago Psyttalia concolor (Szépligeti)
(Canale e Benelli, 2012). Il metodo di lotta biologica più usato nella seconda metà del secolo scorso si basa sull’allevamento di P. concolor su Ceratitis capitata (Wiedemann) e la diffusione in campo del parassitoide con ripetuti lanci inondativi. Questa tecnica, nata negli anni sessanta, mostra problemi legati alla difficoltà di allevamento dell’ausiliario ed ai relativi costi eccessivamente elevati. Nonostante le difficoltà di applicazione, questo metodo riveste un ruolo decisamente importante e pertanto risultano di notevole utilità le ricerche e gli studi indirizzati ad acquisire ulteriori informazioni sulla capacità di ricerca dell’ospite da parte dell’ausiliario, sulla competizione interspecifica, sull’influenza di eventuali ospiti alternativi nell’agro-ecosistema e sulla possibilità di integrazione con altri metodi di lotta. Recenti studi hanno messo in evidenza la possibilità di utilizzare ceppi di
Bacillus thuringiensis (Berlinier) come criterio di lotta microbiologica nei confronti della
mosca. Sono in fase di sperimentazione la selezione di isolati di B. thuringiensis attivi contro il dittero, da impiegare direttamente sul fitofago bersaglio, utilizzando un substrato
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che esercita una forte azione attrattiva sugli adulti. Un ulteriore metodo di difesa microbiologica prevede l’utilizzo di un bioinsetticida a base di spore vive di Beauveria
bassiana (Deuteromiceti) che esercita una interessante azione nei confronti di ditteri
tefritidi, fra i quali B. oleae. In commercio è possibile trovare un formulato (Naturalis) da impiegare singolarmente o in strategie combinate con insetticidi larvicidi, con mass trapping o con insetticidi di origine naturale.
2.3 Lotta biotecnica
La metodologia di controllo biotecnico si basa su tre tecniche: la cattura massale, la confusione sessuale e l’autocidio.
La tecnica di cattura massale (mass killing) prevede l’impiego di trappole attrattive di diverso tipo (forma, colore e materiali) contenenti un insetticida di contatto. Questa tecnica viene effettuata impiegando le stesse trappole utilizzate per il monitoraggio degli adulti, ma con una densità per ettaro più elevata. Si possono utilizzare trappole innescate con attrattivi proteici idrolizzati (alimentari), come le trappole tipo “Berlese“ o “Mc Phail” o sue derivate di nuova generazione quali “Tephritrap”, “Ball trap”, oppure trappole cromotropiche a feromone per aumentare la capacita di attrazione. I prodotti a base di proteine idrolizzate perdono la loro efficacia a causa della degradazione della miscela attrattiva, mentre le trappole cromotropiche con feromone risultano meno attrattive con la progressiva saturazione della superficie collata. La cattura massale è una tecnica in continua evoluzione e costituisce un metodo efficace se applicata su grandi superfici oppure quando le infestazioni compaiono tardivamente. La messa a punto di nuovi dispositivi ad attrazione combinata (alimentare e feromonica), provvisti di superficie avvelenata con insetticidi a elevato potere abbattente e lunga persistenza, ha favorito la loro utilizzazione da parte di olivicoltori associati a grossi comprensori. Questi dispositivi sono stati realizzati in fase sperimentale utilizzando tavolette di legno truciolare innescate con carbonato di ammonio, buminal e feromone sessuale e rese insetticide immergendole
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in una soluzione ad alta concentrazione di deltametrina. L’impiego di trappole contenenti deltametrina, sostanza ad azione neurotossica e ad alto potere abbattente, risulta consentito anche in agricoltura biologica ed in commercio si possono trovare dispositivi pronti all’uso (“Ecotrap”, “Magnet oli”) da distribuire in corrispondenza della fascia media della chioma con una densità che, in funzione del sesto di impianto e delle dimensioni degli olivi, varia da una a quattro trappole per pianta.
Il metodo biotecnico della confusione sessuale prevede la dispersione del feromone dell’insetto nell’ambiente, al fine di disorientare i maschi nella ricerca delle femmine dando origine ad una riduzione dell’entità di riproduzione. In generale questa tecnica dimostra una difficoltà nel controllo dell’infestazione, probabilmente a causa della elevata densità di popolazione del fitofago che si manifesta in campo. Relativamente a B. oleae non sono disponibili al momento sostanze idonee alla messa a punto di questa strategia. Il terzo metodo di controllo biotecnico (autocidio) consiste nella sterilizzazione dei maschi in laboratorio mediante l’esposizione a raggi X ed il successivo lancio in campo. I costi elevati e la difficoltà di mantenere i maschi sterili entro ambiti stabiliti rendono il metodo interessante solo a livelli sperimentali e di difficile applicazione pratica.
2.4 Lotta agronomica
Le condizioni agronomico-colturali che caratterizzano l’oliveto (giacitura, varietà, forme di allevamento, irrigazioni, consociazioni e apporto di elementi nutritivi) rivestono un ruolo importante in un concetto di difesa integrata. Recenti studi hanno dimostrato un diverso comportamento dei genotipi in relazione agli attacchi di B. oleae, mettendo in evidenza una resistenza genetica nell’ambito del patrimonio olivicolo esistente. I risultati ottenuti hanno ripetutamente evidenziato che i genotipi “Bardhi Tirana”, ”Carboncella di Pianacce”, ”Gentile di Chieti”, “Nociara”, “Kokermadh”, “Cellina di Nardò” e “Cima di Mola” mostrano una bassa suscettibilità nei confronti del dittero (Iannotta et al., 2007). La resistenza al fitofago può essere attribuita alla presenza di elevate concentrazioni di
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oleuropeina nella drupa (> 30 mg g-1 polpa fresca) che esercitano un azione inibitrice durante la prima fase di sviluppo della popolazione preimmaginale del dittero. La conferma di ciò è rappresentata dall’elevato numero di punture sterili (uova abortite o comunque non più in grado di generare larve) registrate sulle varietà indicate come poco suscettibili (Iannotta et al., 2007). La progettazione di nuovi impianti con cultivar resistenti all’infestazione attiva della mosca consentirebbe di gestire l’oliveto senza ricorrere ad interventi di lotta, fornendo benefici in termini di costi di gestione e qualità dell’olio. Il controllo agronomico dell’infestazione dacica può essere applicato seguendo l’andamento dell’inoliazione e conoscendo l’epoca ottimale di raccolta nel proprio ambiente. La raccolta anticipata effettuata nel periodo di ottobre, momento antecedente allo sviluppo delle generazioni daciche più imponenti e dannose, oltre a limitare i danni dell’infestazione, favorisce la produzione di olio con caratteristiche qualitative elevate sotto il profilo del contenuto in polifenoli e sensoriale.
2.5 Insetticidi di origine naturale
I pesticidi naturali sono sostanze chimiche che vengono ricavate direttamente da materiale inerte o da vegetali. Si distinguono in “biocidi”, qualora essi uccidano l’insetto (piretrine, rotenone, spinosad), “repellenti” quando agiscono sul comportamento degli adulti (silicato di sodio, lecitina di soia), “fagoinibitori” quando agiscono sulle abitudini alimentari (estratti di neem) e “bioregolatori” nel caso in cui inibiscono lo sviluppo e la metamorfosi. Una particolare attenzione può essere rivolta allo spinosad, un biocida ammesso in agricoltura biologica. La sua elevata azione insetticida si esprime attraverso l’attività di due metaboliti di fermentazione (Spinosina A e Spinosina D) prodotti da un batterio actinomicete appartenente alla specie Saccharopolyspora spinosa (Mertz e Yao). Il nome “Spinos-a-d” deriva dalla specie “spinosa” dell’organismo che lo produce, aggiunto a quello delle due spinosine “A” e ”D”. Questo tipo di prodotto viene ottenuto tramite la fermentazione aerobica del batterio nel suolo che in condizioni ottimali produce 24
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metaboliti biologicamente attivi chiamati spinosine. Lo spinosad si presenta sotto forma di cristalli bianchi, con odore terroso ed è costituito da una miscela di spinosina “A” al 85% e di spinosina “D” al 15%. L’azione esercitata dai due metaboliti si esprime sul sistema nervoso degli insetti. Queste molecole agiscono come un agonista nicotinico alterando il funzionamento dei canali ionici del recettore nicotinico e GABA. La depolarizzazione dei neuroni provoca negli insetti colpiti una ipereccitazione del sistema nervoso dando luogo a contrazioni muscolari involontarie, tremori con conseguente prostrazione, paralisi e morte dell’insetto. Il meccanismo di azione può essere paragonato a quello di un tradizionale fosforganico, infatti lo spinosad risulta attivo nei confronti di insetti appartenenti all’ordine dei coleotteri, lepidotteri, ditteri e imenotteri.
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3. Ipotesi sperimentale: attrattività di componenti secondari presenti
nell’ampolla rettale femminile verso i maschi di B. oleae.
La comunicazione sessuale, nella maggior parte degli insetti, viene esercitata con sostanze chimiche dette feromoni. Queste sostanze vengono percepite mediante sensilli localizzati su antenne, palpi labiali e tarsi, manifestano una elevata bioattività ed il loro utilizzo, in funzione dell’ordine, della famiglia e della specie, risulta più o meno complesso. B. oleae si riproduce per via sessuata, attraverso una forma di riproduzione che esige la fusione dei gameti femminili e maschili (anfigonia). Da un punto di vista comportamentale, la riproduzione prevede il susseguirsi di tre fasi principali. In una prima fase esplicano un ruolo importante gli stimoli di tipo visivo ed olfattivo, e il maschio ricerca attivamente una femmina. La seconda fase si manifesta in un raggio di azione molto ravvicinato e prevede che la femmina si accerti della qualità del maschio valutando le vibrazioni prodotte da esso con il movimento delle ali. L’ultima fase prevede il contatto tra i due individui e la successiva copula (Benelli et al., 2012). L’attività sessuale di B. oleae si svolge durante il tardo pomeriggio o al tramonto (Mazomenos, 1989). Le femmine sono oligogame e si possono accoppiare 1-3 volte durante la loro vita (Cavalloro e Delrio, 1970). I maschi sono poligami (Zervas, 1982).
Nei tefritidi la comunicazione sessuale avviene attraverso la produzione di feromoni in ghiandole associate all’ampolla rettale. In B. oleae gli stimoli olfattivi risultano fondamentali durante le fasi di corteggiamento e copula. Schultz and Boush (1971) identificarono nei maschi di mosca delle olive un complesso ghiandolare associato all’ampolla rettale che si ipotizzava venisse coinvolto nella produzione e stoccaggio del feromone sessuale maschile. Questo complesso si trova anche nelle femmine di mosca delle olive (Economopoulos et al. 1971) e viene comunemente chiamato “ghiandola rettale”. Risulta costituito da un “serbatoio” nella zona laterale posteriore destra della sacca rettale e da una piccola sacca bulbare che si unisce alla base del contenitore. L’intero
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complesso ghiandolare viene circoscritto da una larga e prominente colonna di cellule epiteliali che permette di creare una continuità con l’involucro epiteliale della porzione anteriore della sacca rettale. Entrambi i sessi, prima di rilasciare i composti ghiandolari, accumulano il secreto all’interno del serbatoio. In B. oleae si ritiene che siano le femmine ad attrarre i maschi, contrariamente a quanto noto per gli altri tefritidi, tramite un composto prodotto dalle ghiandole associate all’ampolla rettale conosciuto con il nome di 1,7-dioxaspiro-[5,5]-undecano (olean). La molecola risulta essere il principale composto sintetizzato dalle ghiandole rettali presenti nella femmina. Inoltre è stato dimostrato che le femmine di B. oleae esercitano una attrazione sessuale producendo un feromone costituito da più sostanze ad azione sinergica. Dalle ghiandole rettali vengono prodotti l’olean ed il metil dodecanoato, mentre α-pinene ed il nonanale vengono prodotti a livello cuticolare su tutto il corpo (Mazomenos e Haniotakis 1981, 1985). L’olean viene sintetizzato anche nelle ghiandole associate all’ampolla rettale dei maschi (Canale et al. 2012), ma la molecola viene principalmente utilizzata per attrarre individui sessualmente maturi appartenenti allo stesso sesso e non risulta attrattiva nei confronti delle femmine. Negli individui di sesso maschile la produzione di olean ha inizio fin dal primo giorno come adulto e raggiunge il massimo livello a circa 5-8 giorni di vita, momento in cui si determina la completa maturazione delle gonadi. La produzione del feromone inizia a decrescere nei successivi giorni e si arresta quando i maschi raggiungono l’undicesimo giorno di vita (Canale et al. 2012).
La capacità dei maschi di attrarre le femmine attraverso la produzione di feromoni veniva già evidenziata da De Marzo et al. (1978), ma con risultati poco chiari. Negli ultimi anni sono stati condotti studi per identificare la produzione di feromoni maschili attrattivi nei confronti delle femmine. Recentemente sono stati pubblicati lavori che dimostrano la capacità dei maschi di produrre sostanze attrattive nei confronti delle femmine. Nel lavoro di Carpita et al. (2012) viene identificata la prima sostanza, estratta dalle ghiandole
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annesse all’ampolla rettale maschile, utilizzata come feromone sessuale per attrarre individui di sesso femminile. Questa ricerca mette in evidenza l’utilizzazione dei composti ghiandolari dell’ampolla rettale maschile per la comunicazione sessuale, individuando il muscalure, (Z)-9-tricosene, come sostanza principalmente usata per attrarre le femmine. Il ruolo biologico dello (Z)-9-tricosene è stato individuato effettuando biosaggi con il composto puro sintetizzato chimicamente e biosaggi con gli estratti dell’ampolla rettale di maschi di 15 giorni di età. Il composto puro è risultato attrattivo nei confronti delle femmine a concentrazioni equivalenti a 1,5 - 3 maschi di 15 giorni di età, mentre test con dosi maggiori risultano non attrattivi (Carpita et al. 2012). La produzione di olean da parte dei maschi durante i primi 11 giorni di vita ha portato ad effettuare test attrattivi preliminari utilizzando gli estratti dell’ampolla rettale di maschi con almeno 15 giorni di età. In questo modo è stato possibile saggiare la capacita attrattiva dei composti presenti nell’ampolla rettale maschile nei confronti delle femmine evitando una difficile interpretazione dei biosaggi dovuta alla presenza di olean. Durante i test preliminari, gli estratti si sono dimostrati attrattivi nei confronti di femmine con 15 giorni di vita. L’estratto risultato attrattivo nei confronti delle femmine è stato poi analizzato con GC dimostrando una composizione chimica costituita da differenti sostanze sconosciute. Tra questi composti lo (Z)-9-tricosene risultava essere il miglior candidato come feromone sessuale. Questa molecola esprimeva determinate caratteristiche specifiche come: una elevata volatilità, risultava meno variabile rispetto agli altri composti, la sua concentrazione variava in funzione dell’età, la produzione di questa molecola aumentava in concomitanza della maturazione sessuale dei maschi e non risultava presente in estratti cuticolari di altre parti del corpo effettuati con esano. La concentrazione di (Z)-9-tricosene contenuta nell’ampolla rettale varia in funzione dell’età degli insetti (Carpita et al., 2012). Negli individui sessualmente immaturi il contenuto di muscalure risulta minimo, mentre negli individui con 15 giorni di età la sua concentrazione raggiunge livelli di 42 ng per
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ghiandola. La presenza di altri composti nell’ampolla rettale maschile fa pensare che la comunicazione sessuale in B. oleae venga regolata attraverso l’utilizzo combinato di più sostanze, anche se negli estratti ghiandolari non è stato individuato un altro composto che manifesti caratteristiche specifiche per essere identificato come feromone sessuale. Inoltre, test sul comportamento di B. oleae hanno messo in evidenza, sia sui maschi che sulle femmine, il ruolo di determinate ghiandole urotergali, localizzate in una area ghiandolare ben visibile in corrispondenza del quinto urotergite, durante la comunicazione olfattiva nelle fasi di corteggiamento e accoppiamento. In B. oleae, il secreto di queste ghiandole viene accumulato alla base di setole che si presentano connesse con la struttura ghiandolare localizzata in corrispondenza del quinto urotergite (Raspi et. al., 1997). La composizione chimica del secreto delle ghiandole urotergali risulta sconosciuta, ma l’osservazione di specifici e frequenti comportamenti effettuati dai maschi di 15 giorni di vita durante il corteggiamento, possono coinvolgere le secrezioni delle ghiandole dell’ampolla rettale e delle ghiandole urotergali, che vengono prelevate da strutture presenti sul 3° paio di zampe e successivamente cosparse sull’intero corpo (Canale et al., 2013).
3.1 Obiettivo della tesi
Le ricerche condotte negli ultimi anni hanno ampliato le conoscenze sulla comunicazione sessuale in B. oleae, ma i meccanismi feromonali che regolano il processo di riproduzione durante le fasi di ricerca, corteggiamento e accoppiamento risultano in gran parte sconosciuti. Questa condizione viene messa in particolare evidenza dalla biosintesi nell’ampolla rettale femminile di ulteriori composti (Rossi et al., 1978) che potrebbero essere coinvolti durante il processo di riproduzione. Tra questi composti si possono individuare alcuni esteri degli acidi grassi presenti negli estratti delle ghiandole associate all’ampolla rettale femminile (Carpita et al., 2011). Ulteriori ricerche condotte attraverso studi chimici, fisiologici e comportamentali potrebbero fornire maggiori conoscenze sul ruolo svolto dagli acidi grassi, biosintetizzati dalle ghiandole rettali femminili, durante la
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comunicazione sessuale. Seguendo questo principio, sono state effettuate analisi sugli estratti ghiandolari femminili per individuare feromoni sessuali utilizzati durante il processo di riproduzione. Le analisi effettuate sugli estratti con gascromatografo (GC) e gascromatografo abbinato a spettometro di massa (GC/EI-MS) hanno identificato nove molecole esclusivamente prodotte dalle ghiandole rettali di femmine vergini mature sessualmente e un ulteriore composto, presente anche nei maschi ma sintetizzato in maggiore quantità nelle femmine. Le concentrazioni di queste sostanze sono state quantificate in relazione all’età degli individui e sono stati effettuati biosaggi per valutare le risposte comportamentali e fisiologiche, su entrambi i sessi, di tali dieci composti chimici di origine sintetica. Le sostanze identificate come componenti secondari e impiegate nei seguenti biosaggi sono risultate: l’etil decanoato, il metil laurato, l’etil laurato, il metil miristato, l’n-butil laurato, l’etil miristato, il metil palmitoelato, il metil palpitato, l’etil palpitato e l’etil oleato.
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4. Materiali e metodi
4.1 Allevamento in laboratorio di B. oleae
L’allevamento di B. oleae ha previsto una prima fase di raccolta delle pupe durante l’autunno 2013. Le pupe sono state prelevate in frantoi situati nel territorio regionale toscano e successivamente sono state mantenute, presso i laboratori del Dipartimento di Scienze Agrarie Alimentari e Agro-ambientali di Pisa, in condizioni ambientali di crescita controllate con temperature di 22 °C±1, umidità relativa del 50-60% e fotoperiodo naturale, fino alla comparsa degli adulti. Raggiunta l’età adulta gli insetti sono stati separati, 24 ore dopo lo sfarfallamento, in funzione del sesso e collocati in gabbie cilindriche (Figura 6). Durante il periodo di allevamento gli insetti adulti sono stati alimentati con una dieta secca costituita da levito e zucchero in rapporto 1:10 (Benelli et
al., 2012). Le mosche essendo provviste di apparato
boccale lambente succhiante hanno reso assimilabili i carboidrati dello zucchero e le proteine dei lieviti diluendoli con l’aggiunta di saliva. Per garantire la sopravvivenza degli insetti adulti è stata somministrata acqua utilizzando contenitori in plastica cilindrici, muniti di coperchio con chiusura a vite. Il contatto con l’acqua è stato possibile
praticando due fori sul coperchio, nei quali sono stati inseriti dei batuffoli di cotone che hanno permesso all’insetto di lambire l’acqua risalita per capillarità. Gli adulti, dopo essere stati separati in funzione del sesso, sono
stati mantenuti in crescita controllata fino a quando non hanno raggiunto i quindici giorni di età, momento in cui si è arrestata la produzione di olean delle ghiandole rettali e quindi è risultato possibile testare gli individui senza alterare le risposte durante i biosaggi. Le
Fig. 6 - Gabbie utilizzate per mantenere separati
gli individui
Fig. 7 - Gabbie utilizzate per
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mosche testate venivano poi collocate in gabbie miste (Figura 7), all’interno delle quali esse potevano accoppiarsi e deporre. Ogni 5/6 giorni venivano introdotte nelle gabbie olive sane in modo da permettere alle femmine fecondate l’ovideposizione. Ad ogni cambio le olive introdotte precedentemente venivano levate dalla gabbia, sostituite con olive nuove e collocate in un contenitore (Figura 8) dove avveniva il completamento dello sviluppo preimmaginale. Le pupe venivano raccolte in nuove gabbie, provviste di cibo e acqua (Figura 9), in modo da dare origine a nuovi individui da separare e testare.
4.2 Biosaggi comportamentali
La capacità attrattiva dei composti chimici presenti nell’ampolla rettale femminile è stata valutata effettuando biosaggi preliminari con un olfattometro statico. Durante questa prima fase, i maschi di B. oleae sono stati sottoposti a test comportamentali che hanno previsto l’utilizzo delle dieci molecole identificate nelle ghiandole annesse all’ampolla rettale e l’esano, che essendo una molecola non percepita dagli organi di senso della mosca è quindi risultata come “bianco/controllo” durante il test. Le molecole che hanno manifestato una bioattività nei confronti dei maschi durante i test preliminari in olfattometro statico sono state il metil miristato (metil esadecanoato) e il metil palpitato (metil tetradecanoato), due acidi grassi a quattordici e sedici atomi di carbonio, rispettivamente, presenti nell’ampolla rettale femminile. Successivamente la capacità attrattiva delle due molecole è stata confermata con test effettuati in olfattometro a flusso.
Fig. 8 - Struttura dove vengono completate le fasi
preimmaginali
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4.2.1 Biosaggi effettuati con olfattometro statico
è stato usato un olfattometro costituito da una unità di Plexiglas con dimensioni 15 cm di lunghezza, 15 cm di larghezza e 1,5 cm di spessore, descritto in Carpita et al. (2012). Sul supporto di Plexiglas era presente un foro centrale, in modo da formare una camera circolare con diametro di 40 mm, e due fori in prossimità degli angoli che formavano due camere circolari di grandezza uguale a quella centrale. Due corridoi lineari con lunghezza di 20 mm e larghezza 10 mm, formavano un angolo di 90° e univano le tre zone circolari dando origine ad un percorso continuo. All’interno dell’arena l’insetto poteva muoversi liberamente da una camera laterale all’altra, attraversando sempre la camera centrale. La superficie superiore e quella inferiore sono state coperte con una lastra di vetro removibile che ha permesso di osservare l’insetto durante i test. Gli adulti che dovevano essere saggiati venivano introdotti nell’arena sul pavimento della camera centrale spostando lateralmente il vetro e riposizionandolo immediatamente sopra l’arena. L’individuo aveva un tempo massimo di tre minuti per poter effettuare una scelta tra la molecola da testare e l’esano. La scelta è stata considerata valida quando l’insetto permaneva in una delle camere laterali per un tempo superiore a trenta secondi (Carpita et al., 2012). Gli individui che non hanno effettuato una scelta entro il tempo massimo prestabilito sono stati scartati. Le sostanze chimiche da testare sono state posizionate al centro di una delle due camere laterali, imbibendole su carta da filtro (diametro di 15 mm). Lo stesso procedimento è stato seguito per l’esano che ha occupato la camera laterale opposta. In tutti i biosaggi effettuati, per ogni nuova mosca da saggiare, l’arena è stata ruotata di 90° per eliminare effetti dovuti alla posizione. In questo modo la posizione della molecola è stata randomizzata per evitare che una sostanza si trovasse sempre a destra e l’altra sostanza sempre a sinistra (Benelli e Canale, 2013). Tra un biosaggio e l’altro sono state seguite delle procedure di pulizia dell’olfattometro per evitare effetti di contaminazione delle camere con le sostanze utilizzate. In questo modo le risposte ottenute non sono state alterate ed hanno potuto
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descrivere la bioattività delle molecole saggiate con valori più vicini alla realtà. Alla fine di ogni test la parte in Plexiglas dell’arena e i due pannelli di vetro sono stati lavati prima con esano per circa 30 secondi, poi messi sotto acqua corrente più sapone neutro a 30-40 °C; per circa cinque minuti, rimessa sotto acqua calda per trenta secondi ed in fine pulita con acqua distillata a temperatura ambiente (Carpita et al., 2012). I biosaggi condotti con olfattometro statico sono stati effettuati utilizzando individui con età compresa tra i 10 ed i 15 giorni, periodo in cui cessa la produzione di olean delle ghiandole associate all’ampolla rettale, impiegando le dieci molecole sintetizzate chimicamente, usate in concentrazioni di 1 e 5 femmine equivalenti con 21 giorni di età. Ogni dieci test le sostanze chimiche presenti nei tamponi sono state sostituite. Ogni test è stato replicato 40 volte.
4.2.2 Biosaggi effettuati con olfattometro a flusso
Le molecole risultate attrattive nei confronti dei maschi durante i biosaggi svolti con olfattometro statico sono state successivamente testate utilizzando un olfattometro a flusso per confermare la loro capacità attrattiva. Gli estratti saggiati con questo strumento sono stati due: il metil miristato, acido grasso a quattordici atomi di carbonio prodotto nell’ampolla rettale femminile e il metil palpitato, acido grasso a sedici atomi di carbonio anch’esso prodotto nell’ampolla rettale femminile. L’arena (Figura 10) risultava costituita da una unità in plexiglas con dimensioni 20 cm di lunghezza, 19 cm di larghezza e 1,5 cm di spessore. Sul supporto e stata creata una camera circolare, dove veniva posizionato l’insetto all’inizio del test, collegata ad un corridoio lungo 9 cm e largo 1,5 cm che percorreva la zona centrale. Alla fine, il corridoio si presentava diramato in due corridoi più corti di lunghezza di 7,5 cm e larghezza di 1,5 cm. La superficie superiore e quella inferiore sono state coperte con due pannelli di vetro di grandezza uguale al supporto in plexiglas. I due corridoi della diramazione sono stati collegati ad un tubo di gomma estendibile, inserito in un meccanismo di areazione capace di mantenere separate le sostanze utilizzate nei biosaggi e garantire la circolazione dell’aria immessa nell’arena.
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Fig. 10 - Arena tipo Y-tube
Durante i test è stata fatta passare aria purificata e umidificata all’interno dei tubi in gomma ed è stata immessa nell’arena attraverso connessioni in teflon ad una portata di 1 mL/min. Utilizzando una struttura costituita da tubi in alluminio che formavano una solida
intelaiatura è stato possibile posizionare l’olfattometro orizzontalmente, sospeso da terra ad una altezza di 80 cm. L’intelaiatura è stata utilizzata anche per ancorare due lampade a luce fredda in posizione verticale, ad una altezza di 60 cm, sopra l’olfattometro. Gli individui sono stati introdotti nell’arena al centro della camera circolare presente all’estremità opposta della diramazione. La scelta doveva avvenire in un tempo massimo di tre minuti dopo il rilascio del maschio nell’arena e si considerava valida una risposta quando l’insetto percorreva tutto il corridoio centrale e si soffermava per più di 30 secondi in uno dei corridoi prodotti dalla diramazione terminale (Carpita et al., 2012). Gli insetti che non percorrevano il tratto centrale o che nell’arco della durata massima del biosaggio non si soffermavano per più di trenta secondi in uno dei due corridoi in prossimità della diramazione, producevano una risposta nulla che non veniva presa in considerazione. Le capacita attrattive delle molecole testate sono state saggiate su individui maschi con età
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compresa tra 10 e 15 giorni, utilizzando concentrazioni di uno e cinque femmine equivalenti con età di 21 giorni (Tabella 1). Per testare le molecole sono stati imbibiti dei tamponi costituiti da una porzione circolare di carta assorbente con diametro di 10 mm. Dopo circa 20 secondi, tempo necessario per permettere alla sostanza presente in eccesso sul tampone di evaporare, il tampone è stato inserito in un recipiente di vetro chiuso e collegato all’olfattometro con tubi di gomma. Lo stesso procedimento è stato eseguito per l’esano inserito nel secondo contenitore (controllo). Seguendo il metodo fornito da Ngumbi et al. (2012), dopo aver testato cinque individui, l’olfattometro è stato ruotato lungo l’asse orizzontale di 180° per evitare effetti dovuti alla posizione delle molecole. Dopo dieci individui si è provveduto alla pulizia del supporto seguendo il metodo descritto per l’olfattometro statico e le molecole sono state rinnovate. Per ogni molecola testata sono state acquisite 30 repliche ed ogni test ha previsto la sostituzione dell’individuo testato con un nuovo individuo coetaneo. I biosaggi sono stati effettuati durante il pomeriggio, dalle ore 15:30 alle ore 19:30, nei laboratori dell’Università di Pisa con temperature di 22° C±1 e umidità relativa al 45%±5.
Le scelte effettuate da B. oleae, durante i biosaggi con olfattometro statico e a flusso, sono state successivamente analizzate applicando il test del chi quadro con correzione di Yates per i piccoli campioni. Per la validità delle risposte è stato utilizzato un livello di probabilità P< 0,05.
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Tabella 1 - Sostanze individuate nelle ghiandole rettali di femmine vergini di B. oleae.
Composto Dose (ng)
1 f.e. 5 f.e.
etil decanoato, C10Et 8.45 42.25
metil dodecanoato, C12Me 13.64 68.20
etil dodecanoato, C12Et 32.42 162.10
metil tetradecanoato, C14Me 56.52 282.60
n-butil dodecanoato, C12Bun 8.08 40.40
etil tetradecanoato, C14Et 77.90 389.50
metil (Z)-9-esadecenoato, (9Z)-C16Me 21.00 105.00
metil esadecanoato, C16Me 74.55 372.75
etil esadecanoato, C16Et 87.19 435.95
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5. Risultati e discussione
I biosaggi in olfattometro statico hanno messo in evidenza la capacità attrattiva nei confronti dei maschi di due acidi grassi prodotti dalle ghiandole annesse all’ampolla rettale femminile. Durante gli esperimenti condotti è stato possibile evidenziare la capacità attrattiva del metil miristato (C14Me) e del metil palpitato (C16Me) (Figura 11). La
bioattività del metil miristato a concentrazioni di 1 equivalente femmina con 21 giorni di età si è espressa significativamente, su 40 risposte, con 26 scelte sulla molecola contro 14 risposte su esano (X2 = 4,225 e P = 0.039). Il metil palpitato è risultato attrattivo ad una concentrazione di 5 equivalenti femmina con 21 giorni di età e la capacita attrattiva del composto si è espressa, su 40 risposte, con 27 scelte sula molecola contro 13 scelte nei confronti dell’esano (X2
= 4.225 e P = 0.339).
Fig. 11 - Numero di scelte effettuate durante i test con olfattometro statico da maschi vergini di B. oleae nei confronti delle
sostanze estratte dalle ghiandole annesse all’ampolla rettale femminile e testate a dosi corrispondenti a 1 e 5 femmine equivalenti. L’asterisco indica valori statisticamente significativi.
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Le molecole risultate attrattive in olfattometro statico sono state successivamente saggiate utilizzando l’olfattometro a flusso. I biosaggi condotti con questo metodo hanno confermato solo il ruolo biologico attrattivo del metil palpitato (Figura 12) durante la comunicazione sessuale. Il test del chi quadrato, sulle risposte ottenute testando la molecola a 5 equivalenti femmina con età di 21 giorni, ha prodotto valori di X2 = 5.630 e P = 0.018. I biosaggi svolti con l’olfattometro a flusso non hanno confermato la capacità di attrazione nei confronti dei maschi del metil miristato che veniva messa in evidenza dai test effettuati con olfattometro statico.
I risultati emersi da indagini gas-cromatografiche su ampolle rettali hanno mostrato la presenza di nove composti biosintetizzati e la produzione di un ulteriore composto (etil oleato) presente anche nel maschio ma sintetizzata in maggiore quantità rispetto alle femmine. Le molecole estratte dalle ghiandole rettali confermano i risultati ottenuti con precedenti ricerche che individuano la presenza nell’ampolla rettale di composti come il metil dodecanoato (Mazomenos and Haniotakis 1981, 1985), l’etil tetradecanoato, il metil tetradecanoato, l’etil dodecanoato, il metil (Z)-9-esadecanoato, metil esadecanoato e l’etil esadecanoato (Gariboldi et al. 1983). Vengono quindi individuate per la prima volta tre
Fig. 12 - Numero di scelte effettuate durante i test con olfattometro a flusso da maschi vergini di B. oleae nei confronti delle
sostanze estratte dalle ghiandole annesse all’ampolla rettale femminile e saggiate a diverse concentrazioni, 1 e 5 femmine equivalenti. L’asterisco indica valori statisticamente significativi.
