BONE MORPHOGENETIC PROTEIN

Le Bone Morphogenetic Protein (BMP) sono proteine di segnale che appartengono alla superfamiglia del TGF-β (fattore di crescita trasformante beta) dotate di capacità osteoinduttiva (James H.Beaty, 2002). Il TGF-β, sintetizzato dai condrociti e dagli osteoblasti, ha un ruolo fondamentale nel processo di differenziazione tissutale.

Le BMP sono delle citochine osteoinduttive capaci di indurre la formazione di tessuto osseo e cartilagineo in associazione a carrier osteoconduttivi, quali il collagene o l’idrossiapatite.

Oltre alle proprietà osteogenetiche le BMP-2 giocano un ruolo importante nella morfogenesi cardiaca ed i recettori per tali citochine sono espressi dalle cellule di vari organi come polmone, milza, encefalo, fegato, piccolo intestino, prostata ed ovaie.

La Proteina Osteogetica-1 (OP-1) si è mostrata capace di indurre la formazione di osso, anche in presenza di infezioni. (Chen X., 2002).


Le funzioni delle BMP sono plurime: oltre al loro coinvolgimento nella formazione di tessuti ossei e cartilaginei, concorrono indirettamente alla formazione dell’ambiente idoneo per lo sviluppo del midollo osseo rosso e contribuiscono all’ematopoiesi.

Altri studi evidenziano la capacità delle BMP di indurre la differenziazione cellulare all’interno delle linee cellulari della doccia neurale in particolare dei tipi cellulari dorsali e intermedi (Samartzis et al; 2005).

Le BMP intervengono anche nello sviluppo del SNC (Sistema Nervoso Centrale) promuovendo lo sviluppo della linea cellulare dell’astroglia e sono necessarie per la sopravvivenza delle altre linee cellulari embrionali (Samartzis et al; 2005).

La funzione delle BMP è stata per la prima volta identificata negli anni ’60 (Urist M.R; 1965), ma la proteina responsabile della induzione ossea rimane sconosciuta fino al sequenziamento ed alla purificazione della BMP 3 bovina (denominata Osteogenina) ed alla successiva sintesi di H (Human) BMP 2 e 4 di origine umana, avvenuta verso la fine degli anni 80’ inizio anni 90’ (Wozney, J.M. et  al.; 1988; Luyten, F.P. et  al.; 1989; Wozney, J.M. 1992).

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Tabella2: riassume le classi di BMP e le rispettive funzioni

BMP FUNZIONE

BMP 1 agisce sul procollagene I, II e III . E 'coinvolto nello sviluppo della

cartilagine

BMP2 osteoinduttivo, differenziazione osteoblasti, apoptosi

BMP3 il più abbondante BMP delle ossa, promuove l' osteogenesi

BMP4

regola la formazione di denti,polmoni e ossa dal mesoderma.Gioca un ruolo importante nella riparazione di fratture,formazione epidermide e sviluppo dei follicoli ovarici

BMP5 condrogenesi

BMP6 condrogenesi, differenziazione osteoblasti, omeostasi Fe

BMP7 osteoinduttivo,induce la produzione di SMAD1, differenziazione

osteoblasti, sviluppo di rene e occhio

BMP8a coinvolto nello sviluppo di osso e cartilagine

BMP8b espresso nell' ippocampo

BMP9 sistema nervoso, sistema reticoloendoteliale epatico, epatogenesi

BMP10 sviluppo cardiaco nell' embrione

BMP11 arricchisce il tessuto neuronale e mesodermico

BMP12 induce la formazione di tessuto tendineo

BMP13 induce la formazione di tessuto simil tendinoso e legamentoso

BMP14 condrogenetico, migliora la guarigione tendinea e la formazione di tessuto

osseo

66 Con una decisione storica il FDA ha poi approvato nel 2002 l’uso delle BMP (in particolare delle BMP-2) per interventi di fusione ossea della porzione craniale dei corpi vertebrali delle vertebre lombari (ALIF: Anterior Lumbar Interbody Fusion).

Successive valutazioni e studi di biologia molecolare mediante le tecniche di DNA ricombinante, hanno permesso di ottenere una migliore conoscenza della sintesi di tali proteine e della loro capacità osteoinduttiva e la loro possibile applicazione in neurochirurgia è ulteriormente incrementata (Samartzis et al; 2005).

E’ stata riscontrata la presenza di tre recettori cellulari tipo I per le BMP: tipo IA e IB BMP-receptors (BMPR-IA o ALK-3; e BMPR-IB o ALK-6) ed il tipo IA recettore per l’activina (ActR-IA o ALK-2) (Koenig, B.B. et al.; 1994; Ten Dijke, P. et    al.; 1994; Macias-Silva, M. et al.; 1998).

Stessa cosa per i recettori tipo II per le BMP: si possono trovare infatti i recettori cellulari tipo II (BMP-II) ed il tipo II e IIB per i recettori dell’activina (ActRII and ActR-IIB) (Yamashita, H. et    al.; 1995; Rosenzweig, B.L. et    al.; 1995; Kawabata, M. et  al.; 1995). Mentre BMPR-IA, IB e II sono recettori specifici per le BMP, i recettori ActR-IA, II e IIB si possono legare anche con l’activina. Tali recettori sono espressi in maniere differente nei vari tessuti. I recettori tipo I e II per le BMP sono entrambi essenziali per la trasduzione del segnale.

Dopo che è avvento il contatto tra ligando e recettore di membrana, si forma un complesso eterotetramerico attivato costituito da due paia di recettori cellulari tipo I e II (Moustakas et al, 2002).

L’attività delle BMP è regolata a livello locale dalla presenza di svariati antagonisti. Una elevata espressione di antagonisti delle BMP influenza negativamente la guarigione di una frattura; tali antagonisti possono essere divisi scolasticamente in funzione dell’ambiente in cui essi esplicano la loro azione sia lo spazio extracellulare o viceversa quello intracitoplasmatico.

Al primo gruppo appartengono molecole come la Noggin, la Chondrin, in TSG (twisted gastrulation), Gremlin, Follistatin e BMPER, proteine che formano un complesso con BMP evitando che gli epitopi si leghino con i recettori di membrana. (S.J.E. Matthews; 2005 ).

67 Altra molecola che presenta funzione inibitoria nei confronti delle BMP è la BMP 3, la quale induce l’attivazione di un TGF-α per una via dell’activina inibendo di conseguenza il segnale osteogenico delle BMP. Esiste poi una proteina di membrana (CRIM1) ricca di cistina, simile alla già citata Chordin che regala la velocità di processazione e distribuzione di BMP sulla superfice di membrana.

Ancora, una proteina transmembrana con un dominio extracellulare molto simile ai recettori tipo I per le BMP; la proteina BAMBI (BMP and activin membranebound inhibitor) non presenta però il dominio intracioplasmatico della chinasi ed interferisce così con la trasduzione citolasmatica del segnale delle BMP.

Esiste infine un corecettore transmembrana, l’endoglin (CD105), che interviene nella regolazione di vari costituenti della superfamiglia del TGF-α, inclusi lo stesso TGF-α e le BMP. La down regulation dell’endoglin esita in una riduzione del segnale delle BMP con un effetto positivo nei confronti dell’attività delle BMP stesse.

Passando ora ad esaminare il versante intracellulare si deve ricordare come antagonisti alcune della proteine SMAD (dall’inglese Small Mother Against Decapentaplegic). Troviamo così le SMAD6, SMAD7 e SMAD8b e le SMURF1 and SMURF2 che intervengono nell’attivazione dell’ R-SMAD o facilitano la loro degradazione proteosomale. Inoltre bisogna ricordare che la SMAD 4 (responsabile della trasduzione del segnale una volta fosforilata) può essere fosforilata sia dalla porzione C-terminale intracitoplasmatica del recettore di membrana tipo I ma anche da altri enzimi citoplasmatici (Erk, P38 e JNK MAP proteochinasi e successivamente da GSK-3) con un conseguente accumulo intracitoplasmatico e successiva degradazione proteosomica della SMAD1 (Suzanne N. Lissenberg-Thunnissen et al.; 2011).

Studi preclinici suggeriscono che il dimero attivo di BMP presenta attività chemiotattica nei confronti delle cellule staminali indifferenziate di origine mesenchimale, richiamandole verso la regione ossea che presenta un deficit o una lesione ( Wozney JM et Rosen V.; 1998).


Il segnale deve essere ora trasdotto dalla membrana cellulare verso i geni target a livello nucleare. Entrano in gioco a questo punto le già citate SMAD, una famiglia di proteine citoplasmatiche che modulano l'attività dei ligandi del TGF-β.

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Fig. 28: trasduzione del segnale delle BMP all’ interno di una cellula (Nature Biotechnology 21, 1025 - 1032

-2003)

L’osteoinduzione sembra essere mediata dall’azione delle R-SMAD (SMAD 1, 5 e 8). In particolare le SMAD 1 e 5 sono attivate dal recettore di membrana tipo I per le BMP, mentre il recettore tipo IA con affinità anche per l’activina (ActR-IA o ALK-2) può attivare tutte e tre le forme di R-SMAD 8 (Hoodless, P.A. et    al.; 1996; Chen Y. et  al.; 1997; Nishimura R. et  al.; 1998).

Dopo essere state fosforilate le R-SMAD vengono rilasciate nel citoplasma e vanno ad interagire con la proteina SMAD 4 (Co-SMAD), che si comporta da mediatore comune nella trasduzione del segnale. Il complesso così costituito migra nel nucleo e partecipa alla

69 trascrizione dei geni con altri fattori di trascrizione, stimolando la proliferazione cellulare e la trasformazione concentrazione-dipendente delle cellule figlie, in condroblasti o osteoblasti.

Le SMAD 6 e 7 competono con la SMAD 4 per i siti di fosforilazione e sembra siano per questo coinvolte nella inibizione delle proprietà osteoinduttive delle BMP (Sandrà Marek Szplaski e Robert Gunzburg, 2005).

Le BMP inoltre promuovono la neoangiogenesi durante le fasi di ossificazione tramite un meccanismo che coinvolge il VEGF-A (Vascular Endothelial Growth Factor-A) di origine osteoblastica (Sandrà Marek Szplaski e Robert Gunzburg, 2005).

L’azione combinata di più BMP è implicata tanto sia nella condrogenesi che nell’osteogensi, quanto nella calcificazione e nel rimodellamento del callo osseo (S.J.E. Matthews; 2005).

La sintesi delle varie classi di BMP non è costante nel tempo ma varia in funzione della fase della guarigione ossea che si prende in considerazione. In generale comunque le BMP inducono una sequenza di eventi a cascata che interessano la condrogenesi, l’osteogenesi, la neoangiogenesi e la sintesi della matrice extracellulare (Suzanne N. Lissenberg-Thunnissen et al.; 2011).

La cicatrizzazione dei tessuti duri per seconda intenzione può essere divisa in tre fasi: la fase infiammatoria che va dal primo al sesto giorno; la fase condrogenetica che va dal settimo al nono; ed infine la fase osteogentica che va dal decimo al tredicesimo giorno. In un articolo di S.J.E. Matthews è riportato uno studio di Onishi et al sulle BMP (S.J.E. Matthews; 2005). In tale studio Onishi et al sono andati a ricercare la localizzazione delle BMP 2, 4 e 7 e il recettore di BMP di membrana tipo II (BMPR-II) nelle fasi di ossificazione membranosa ed encondrale (OnishiT et al.; 2002).

Lo studio ha riscontrato la presenza delle BMP-2, 4 e 7 nelle primissime fasi di guarigione della frattura (dal giorno 1 al giorno 7) a livello dello spessore del periostio, in prossimità della rima di frattura e ciò coincideva con la massima espressione dei recettori BMPR II. Dal giorno 7 in poi le BMP 2, 4 e 7 sono state evidenziate a livello dei condrociti presenti nell’osso subcondrale così come in cellule fusiformi tipo fibroblasti.

70 Dal giorno 14 in poi le BMP-7 non sono state più rilevate a livello dei condrociti maturi mentre le BMP-2 e 4 continuano ad essere espresse a livello di vari condrociti fino agli ultimi stadi della cicatrizzazione. Le BMP-2, 4 e 7 sono state riscontrate anche a livello dell’osso trabecolare neoformato in cellule multinucleate simil-osteoclasti. Hanno notato poi che i BMPR-II erano attivamente espressi sia in caso di calcificazione encondrale che di quella intramembranosa.

Da ciò, ed altri Loro studi antecedenti, conclusero che le BMP-7 erano espresse in maniera predominante nelle fasi iniziali della cicatrizzazione encondrale, mentre le BMP-2 e 4 entrano in gioco durante tutte le fasi di cicatrizzazione.

In un altro studio Cheng et all. hanno evidenziato come sia presente un modello gerarchico tra l’attività delle varie BMP e come in tal proposito le BMP-2, 6 e 9 inducano la differenziazione osteoblastica delle cellule mesenchimali totipotenti, mentre la maggior parte delle altre BMP stimolino l’osteogenesi nelle cellule osteoblastiche mature (Cheng H et al.; 2003). Cho et al. hanno esaminato l’espressione delle proteine della superfamiglia del TGF-β durante i 28 giorni necessari alla guarigione di una frattura nella tibia di topo in uno studio del 2002 (Cho TJ et al.; 2002).

Lo studio ha evidenziato come le BMP-2 e il GRDF-8 (Growth Differentiation Factor 8) mostrino la massima espressione dal giorno successivo alla frattura mentre le BMP-3, 4, 7 e 8 mostrino un ristretto periodo di attiva sintesi tra il giorno 14 e 21. 


Sempre S.J.E. Matthews riporta studi dell’utilizzo di BMP-2 e BMP-7 in modelli animali ed umani; riferendosi ad un articolo del 2002 di Govender et al, ricorda come i primi impieghi di tali proteine morfogeniche riguardavano la chirurgia spinale per la fusione dei corpi vertebrali (Govender PV et al.; 2002) mentre un altro articolo del 2005 di Makino et al. riporta l’uso delle BMP-7 nel trattamento delle pseudoartrosi e nei difetti ossei diafisari (Makino T et al.; 2005).

5.2 BMP-2

La BMP-2 è una proteina dal peso di 26KDa, composta da due identiche catene da 114 aminoacidi unite tra loro da un singolo legame disulfide.

71 Ogni monomero BMP-2 si presenta come la parte C-terminale di un polipeptide precursore, che contiene anche una sequenza segnale di 23 aminoacidi per la secrezione, ed un polipeptide da 259 aminoacidi.

Fig. 29: modello di BMP-2 creato con l’uso di Cn3D

(https://en.wikipedia.org/wiki/Bone_morphogenetic_protein_2)

Dopo dimerizzazione di questo precursore, i legami covalenti tra il propeptide (che è anche esso un omodimero disolfuro) e la BMP 2 “matura” vengono scisse da un proteasi furin- type.

La RhBMP-2 (Recombinant Human BMP-2) è una proteina omodimerica 26 KDa costituita da due catene polipeptidiche di 115 aminoacidi.

La sequenza amminoacidica è nota ed è la seguente:

MQAKHKQRKR LKSSCKRHPL YVDFSDVGWN DWIVAPPGYH AFYCHGECPF PLADHLNSTN HAIVQTLVNS VNSKIPKACC VPTELSAISM LYLDENEKVV

L K N Y Q D M V V E G C G C R

In uno studio del 1992 Alan w. Yasko et al hanno valutato l’utilizzo delle RhBMP-2 come sostituti di trapianti ossei in caso di presenza di gap ossei. L’impianto sottocutaneo di RhBMP2 in topi, ha esitato nell’induzione locale di formazione di tessuto osseo per via

72 encondrale. Per valutare la capacità osteoinduttiva ortotopica le RhBMP-2 sono state applicate in un gap osseo di 5 mm creato al livello della diafisi femorale di 45 topi adulti.

Le RhBMP-2 sono state posizionate in loco in un carrier di matrice ossea demineralizzata. Lo studio ha evidenziato come la guarigione ossea del gap iatrogeno avveniva per via encondrale con guarigione radiografica, istologica e resistenza a stimoli di tipo meccanico. Lo studio ha dimostrato come le RhBMP 2 si possano usare come valido sostituto di trapianti ossei o in qualsiasi altra condizione clinica che necessita osteogenesi (Alan Lan W. Yasko et al.; 1992).

In uno studio di Groeneveld E.H.J. e Burger E.H. del 2000, si parla dei primi risultati ottenuti in campo umano con l’utilizzo delle RhBMP, in particolare le isoforme BMP-2 e BMP-7. Lo studio non mette in dubbio la capacità osteoinduttiva delle proteine ricombinanti, in più mette in luce la possibilità che la concentrazione minima efficace di BMP in pazienti umani, possa dipendere anche da condizioni proprie dell’ambiente in cui il farmaco viene impiegato, dall’aiuto fornito da ormoni e fattori della crescita secreti dall’organismo e dalla presenza di cellule target per le BMP. Lo studio riporta anche una tabella che esplica quelle che erano le varie funzioni attribuite alle BMP al momento della ricerca (Groeneveld E.H.J. and E H Burger; 2000).

Tabella 3: panoramica di identificazione e clonazione delle BMP, ed il loro ruolo nella osteoinduzione. (E H

73 Kang et al. in uno studio del 2004 hanno cercato di identificare la capacità osteoinduttive delle varie 14 proteine morfogenetiche, notando come BMP 6 e 9 effettivamente inducano l’ossificazione ortotopica, la BMP 3 è risultato essere in grado di inibire l’ossificazione ortotopica indotta dalle BMP 2, 6 e 7, mentre non era in grado di inibire quella indotta da BMP 9. Lo studio si concludeva affermando che lo proteine con maggiore capacità osteoinduttiva fossero la BMP 6 e 9 (Kang Q, Sun MH et al.; 2004).

In uno studio del 2004, D.R. Summer et al. sono andati a valutare la capacità delle RhBMP2 di stimolare la guarigione di un gap osseo attorno ad un impianto ortopedico, nel caso in cui la proteina morfogenetica sia applicata direttamente sulla superfice porosa dell’impianto.

Lo studio ha dimostrato come l’applicazione locale di RhBMP 2 stimola marcatamente la rigenerazione ossea nel gap iatrogeno a livello periplantare (3,5 volte maggiore rispetto al gruppo di controllo). In questo studio, non vi è alcuna prova dell’attività condrogenica delle RhBMP2. La crescita ossea a livello del gap è di tipo intra-membranosa e sembra che l'applicazione delle RhBMP 2 in questa situazione acceleri la formazione di osso tramite questa via piuttosto che inducendo l’ossificazione encondrale (D.R. Sumner et al.; 2004). In uno studio di Gavin B. Bishop e Thomas A. Einhorn del 2007 vengono valutate quelle che sono le possibili applicazioni delle BMP in campo medico mostrando un livello di efficacia e sicurezza pari a quelli forniti dall’autotrapianto osseo. In campo umano le BMP sono approvate per il trattamento delle pseudoartrosi, delle fratture aperte di tibia e per la fusione dei corpi vertebrali in chirurgia spinale.

Un settore che rimaneva inesplorato era quello che vedeva l’impiego delle BMP, sempre a scopo osteoinduttivo, tramite la somministrazione per via percutanea a livello della lesione ossea. Tale pratica, secondo gli autori, presentava diversa vantaggi come ad esempio la mininvasività del trattamento, sia che si stesse trattando una pseudoartrosi sia nel caso fosse impiegata per accelerare la guarigione delle fratture chiuse.

In campo di ingegneria tissutale le BMP posso offrire molte possibilità. Viene addirittura ipotizzato l’impiego delle proteine per la ricostruzione di difetti ossei, siano essi di natura traumatico/degenerativa che congeniti (Gavin B. Bishop and Thomas A. Einhorn; 2007).

74 In uno studio del 2007 Carl A. Kirker-Head et al. riporta una casistica di quelle che sono le principali applicazioni delle BMP in campo medico veterinario. Come altri riporta quelli che sono gli usi consentiti in campo umano per le BMP-2 e BMP-7, facendo notare come i prodotti utilizzati in campo medico umano siano anche disponibili per la medicina veterinaria. Tra le applicazioni specifiche delle BMP riporta il trattamento di fratture e pseudoartrosi, trattamento di deficit ossei a carico delle ossa lunghe, osteogenesi per distrazione, ostointegrazione degli impianti metallici (come già riportato in precedenza in altri studi), chirurgia maxillofacciale, odontoiatria in caso di lesioni periodontali, fusione dei corpi vertebrali.

Lo studio riporta inoltre che la risposta osteoinduttiva, si manifesta con andamento generalmente dose dipendente ed inversamente proporzionale alla posizione, all’interno della scala evolutiva, dell’animale trattato (Kirker-Head CA.; 2000). Kirker sottolinea Kirker anche come la quantità di RhBMP (2 o 7) necessaria per manifestare capacità osteoinduttiva, è svariate volte maggiore della dose di BMP endogena, prodotta a livello della frattura o proveniente da un autotrapianto spongioso. Ciò è conforme con quanto sempre riportato in letteratura secondo cui l’autotrapainto di osso spongioso sia il gold- standard per osteoinduzione, osteoconduzione e potenzialità osteogenetica, contrariamente alle RhBMP il cui potenziale varia in funzione della presenza di cofattori locali, della popolazione di osteoblasti e cellule osteoprogenitrici (Kirker-Head; 2007).

L’articolo del 2007 di P. Giannoudis et al riporta gli studi effettuati in precedenza con RhBMP 2 e 7 su tibia di pecora, radio, ulna e femore di topo e come tali proteine accelerino la guarigione ossea di un 30-40%. Giannoudis riporta anche uno studio su scimmie, in cui l’associazione tra RhBMP2 e α-BSM (Bone Substitute Material) accelera la guarigione di una frattura del 40%, tramite una sola somministrazione per via percutanea. Gli autori ricordano comunque che possono esistere differenze interspecifiche che interessano lo stimolo meccanico a livello del focolaio di frattura, come delle differenti risposte alle proteine, presumibilmente legate alla specie animale in esame. Differentemente nell’uomo la maggior parte degli studi si concentrano su patologie specifiche come la frattura aperta di tibia (associata ad alto rischio di sviluppo di pseudoartrosi) in cui l’uso delle RhBMP2 evidenzia una riduzione dal 46 al 26% della necessità di revisione chirurgica. Inoltre

75 riportano come pochi siano gli effetti collaterali riportati in letteratura per l’uso delle RhBMP (reazioni di tipo tossico o immunoallergico senza conseguenze cliniche su lunghi tempi).

D’altra parte è riportato un eccesso nella produzione locale di tessuto osso a livello dell’impianto ed in siti ectopici (Peter Giannoudis et al.; 2007).

Sempre nel 2007 in un articolo di G. Schmidmaier et al, vengono elencate quelle che possono essere le prospettive in campo umano per l’utilizzo delle BMP. Viene anche riportato uno studio compiuto nel 2003 secondo cui l’inoculazione percutanea di BMP potrebbe essere una valida alternativa mininvasiva al trattamento dei ritardi di consolidamento e delle pseudoartrosi (Li RH, Bouxsein ML, Blake CA, et al. RhBMP-2 injected in a calcium phosphate paste (α-BSM) accelerates healing in the rabbit ulnar osteotomy model. J Orthop Res 2003;21 997-1004). Schmidmaier et al ricordano inoltre come, nel caso in cui sia necessaria anche una stabilizzazione mediante mezzi di osteosintesi “de novo”, si possa optare per la scelta di mezzi trattati con BMP per una somministrazione locale di fattori osteoinduttivi (sia per il trattamento delle fratture complicate, sia per prevenire lo sviluppo di pseudoartrosi) (G. Schmidmaier et al.; 2007). In uno studio del 2009 di T. William Axelrad et Thomas A. Einhorn riporta come la velocità di guarigione ossea sia comparabile se non addirittura migliore di quella ottenibile mediamente dall’autotrapainto di osso spongioso (T. William Axelrad et Thomas A. Einhorn; 2009).

In uno studio di Nao Tsuzuki et al. del 2014 viene valutata l’efficacia del trattamento di difetti ossei con una associazione di cellule mesenchimali e BMP-2 in carriers biodegradabili a base di Gelatine e β-Tri Calcio Fosfato in soggetti equini. Il protocollo prevedeva la realizzazione di deficit ossei di 1 cm a livello dei metacarpei principali. I gap ossei vengono colmati col biomateriale ed i soggetti seguiti per un trial clinico di almeno 16 settimane. Lo studio dimostra come la guarigione radiografica del difetto trattato col biomateriale sia radiograficamente guarita in tempi minori rispetto al caso controllo. Stessa cosa vale per la valutazione con diagnostica per immagini avanzata (TAC) e per l’esame istologico. A tal proposito lo studio conferma che il trattamento con BMP-2 può accelerare