IL CAMPIONE

Le cellule umane utilizzate in questo studio sono state fornite dal gruppo di ricerca del prof. Marchetti, della U.O di Malattie del Metabolismo e Diabetologia dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana.

Le isole umane di pancreas sono state ottenute da pancreas di donatori e sottoposte a un trattamento di digestione enzimatica con collagenasi e purificazione in gradiente di densità.

Al termine della procedura di isolamento, le cellule sono risospese in mezzo M199, contenente il 10% di siero e antibiotici (100 units/ml di penicillina,

53 100 μg/ml di streptomicina, 50 μg/ml di gentamicina e 0.25 μg/ml di amfotericina B) e messe in coltura per 24h a 37°C nell’incubatore. In esperimenti paralleli le cellule sono incubate 24h in presenza di un cocktail di citochine (50 U/ml IL-1β plus 1000 U/ml IFN-γ).

3.2.1 Preparazione del campione

Si procede rompendo le cellule e solubilizzando le proteine, così da poter effettuare l’analisi proteica. Poiché le proteine, una volta estratte dalle cellule, si trovano in condizioni non ottimali per la loro stabilità e funzionalità, si deve intervenire al fine di ridurre le condizioni e/o gli agenti che possono denaturarle.

Il campione viene preparato seguendo questa serie di passaggi:

1. Si trasferiscono le cellule dalla fiasca in una falcon da 50 ml, lavando bene la fiasca con 10 ml di PBS a 37°C, in modo da non perdere campione.

2. Si centrifuga a 1200 rpm per 5 minuti e si elimina il surnatante. 3. Si risospende il pellet in 10 ml di PBS a 37°C.

4. Si centrifuga a 1200 rpm per 5 minuti e si elimina il surnatante. 5. Si risospende il pellet in 200 μl di PBS e trasferimento del

campione in un’eppendorf.

6. Si procede al lavaggio della falcon con 200 μl di PBS e si ripete l’operazione con ulteriori 100 μl di PBS. Il volume finale nella eppendorf è di 500 μl.

7. Si centrifuga a 500 g per 3 minuti e si elimina il surnatante. 8. Si risospende il pellet in 100 μl di soluzione di sospensione (SS),

54 2M, Chaps 4 %, DTT 60 mM, Blu di Bromofenolo 0.002 %, H2O mQ), NaF 50 mM, Na3VO4 2 mM e nicotinammide 10 mM. Il DTT

(ditiotreitolo) ha la funzione di mantenere i gruppi mercapto (- SH) delle proteine in forma ridotta ed impedire la formazione di ponti disolfuro impropri. Na3VO4 e NaF sono inibitori delle

fosfatasi.

9. Si aggiunge 1 μl di tricostatina (1 μM) e 1 μl/106 cellule inibitori delle proteasi. Si agita bene per circa 5 minuti, a intervalli. La tricostatina è un inibitore delle deacetilasi, mentre gli inibitori delle proteasi evitano la digestione proteica dovuta all’azione delle proteasi intracellulari.

10. Si effettua la sonicazione: 5 volte per 4 secondi. Si agita bene e si lascia solubilizzare per circa 40 minuti. La sonicazione ha lo scopo di rompere le membrane cellulari mediante l’utilizzo di ultrasuoni. È necessario prestare attenzione all’eccessivo sviluppo di calore. 11. Si centrifuga a 17000 g per 5 minuti. A questo punto si valuta la

presenza o meno di pellet. Se è presente un pellet consistente può rendersi necessaria l’aggiunta di altra SS e un ulteriore processo di sonicazione. Se il pellet è piccolo si procede con l’esperimento. 12. Si incuba per circa 2 ore, agitando spesso. Questo periodo di

incubazione ci assicura che vengano rotte sia le cellule che i mitocondri.

13. Si centrifuga a 1700 g per 5 minuti. Si utilizza il sovranatante per gli esperimenti successivi e si conserva in ogni caso il pellet eventualmente presente.

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3.2.2 Dosaggio proteico RC-DC Biorad

Il dosaggio proteico RC-DC (reducing agent compatible/detergent compatible) è un saggio colorimetrico per la determinazione quantitativa delle proteine, che si effettua in presenza di agenti riducenti e detergenti. Conserva tutte le caratteristiche originali del precedente saggio DC, ma è stato modificato per essere compatibile ai reagenti riducenti (RC-reducing agent compatible) e ai detergenti (DC-detergent compatible). Anch’esso come il precedente saggio DC si basa sul metodo di Lowry, che prevede la costruzione di una retta di taratura tramite la lettura dell’assorbanza (750 nm) di una proteina di riferimento a diverse concentrazioni. Il dosaggio si basa sulla reazione che avviene tra le proteine e una soluzione di tartrato di rame e reagente di Folin: a pH alcalino le proteine reagiscono con il rame provocando una riduzione del reagente e producendo specie riducenti che presentano colorazione blu. L’intensità di questa colorazione è direttamente proporzionale alla concentrazione proteica. La proteina standard di cui ci siamo serviti per costruire la retta di taratura è l’albumina sierica bovina (BSA), la quale deve essere sospesa nella stesso solvente in cui sono sospesi i campioni per non generare interferenze che potrebbero falsare i risultati.

Il kit Biorad è costituito da::

• Reagente A: soluzione alcalina di tartrato di rame. • Reagente B: reagente Folin.

• Reagente S: soluzione surfactante. • Reagente I: agente riducente. • Reagente II: agente riducente.

Si costruisce la retta di taratura operando in doppio e a temperatura ambiente. Le diluizioni della BSA sono indicate nel protocollo e sono riportate nella tabella 1.

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RS μl BSA μl [BSA]μg/ml μg BSA

Bianco 25.0 - 0 0

1 21.7 3.3 0.2 5

2 18.3 6.7 0.4 10

3 11.7 13.3 0.8 20

4 - 25 1.5 37.5

Tabella 1- Diluizioni della BSA per la costruzione della retta di taratura nel dosaggio RC/DC I campioni sono stati diluiti 1:5 per avere un volume finale di 25 μl e anch’essi sono preparati in doppio come gli standard.

Si procede secondo i seguenti passaggi:

1. Aggiungere 125 μl di reagente I agli standard e ai campioni, agitare su Vortex e incubare per 1 minuto.

2. Aggiungere 125 μl di reagente II ad ogni eppendorf, agitare su Vortex e centrifugare a 12000 g per 5 minuti a 20°C.

3. Aspirare il surnatante e conservare il restante pellet

4. Aggiungere 125 μl di reagente ad ogni eppendorf, agitare e lasciare incubare per 1 minuto.

5. Aspirare il surnatante e aspirare 127 μl di soluzione A* (composta da 20μl di soluzione S e 1000 μl di soluzione A), agitare su Vortex e incubare per 5 min.

57 7. Leggere le assorbanze di standard e campioni allo spettrofotometro a

750 nm.

Mediante le assorbanze degli standard si costruisce la retta di taratura, che si presenterà nel seguente modo: y=mx, dove y rappresenta il valore dell’assorbanza, m la pendenza della retta e x la concentrazione proteica. Grazie all’equazione della retta, si calcolano le concentrazioni dei campioni incogniti mediante la seguente formula:

(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙𝑙𝑒 𝑎𝑠𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑧𝑒 𝑑𝑒𝑖 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑖𝑜𝑛𝑖 − 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑖 𝑏𝑖𝑎𝑛𝑐ℎ𝑖)

𝑝𝑒𝑛𝑑𝑒𝑛𝑧𝑎 𝑑𝑒𝑙𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑡𝑡𝑎 ×𝑓𝑎𝑡𝑡𝑜𝑟𝑒 𝑑𝑖 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑧𝑖𝑜𝑛𝑒 = 𝑚𝑔

𝑚𝑙

3.3 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE