carcasse di animali rinvenute nelle aree di studio. Se lo stato di putrefazione della carcassa non è
eccessivo, questi campioni possono fornire DNA abbondante di buona qualità, e quindi generare genotipi privi di errori che sono utilizzati come riferimento per stimare, per es., le frequenze alleliche della popolazione in modo indipendente dall’utilizzo dei genotipi ottenuti dai campioni non-invasivi. I
campioni di tessuto sono sempre conservati immersi in etanolo 70-90%, rispettando il rapporto di volume da 1:4 a 1:10.
Il punto fondamentale di ogni procedura di conservazione è la necessità di conservare i campioni dessicati ed al riparo da fonti di umidità. L’umidità favorisce la crescita batterica e l’attivazione di enzimi endogeni ed esogeni di degradazione del DNA. I peli devono quindi essere conservati essiccati ed al riparo da fonti di umidità. I peli possono essere conservati per brevi periodi di tempo semplicemente essiccati a temperatura ambiente in buste pulite di carta, oppure essiccati in buste di plastica con silica
(deumidificatore), oppure (ed a nostro parere, meglio) in etanolo a temperatura ambiente o (meglio ancora, anche se non obbligatoriamente) in congelatore. I campioni non-invasivi possono essere conservati anche in congelatore senza alcool o dessicante. Occorre però tenere ben presente il rischio che i congelatori si rompano, che i campioni si sgelino ed assorbano umidità che può produrre contaminazioni e degradazioni del DNA. Una combinazione di silica e congelatore può limitare, ma non evitare un peggioramento della qualità del DNA estratto da peli conservati per più di sei mesi. E’ comunque fortemente consigliabile estrarre appena possibile il DNA. La conservazione di campioni di escrementi è più problematica, perché la
concentrazione di svariati DNA “contaminanti” (alimenti, batteri, vegetali. ecc. …) è sempre superiore alla concentrazione del DNA target, e spesso (in relazione alla dieta) gli estratti di DNA contengono composti che inibiscono la PCR e che vengono co-purificati con il DNA. Sono stati valutati diversi metodi: silica, etanolo, differenti tipi di buffer (DMSO, EDTA, Tris e DET), sia a temperatura ambiente che in congelatore, per periodi più o meno lunghi di tempo. Si sono ottenuti risultati non univoci, poiché escrementi di specie diverse presentano metodi di conservazione ottimali che differiscono da quelli di altre specie Tuttavia nessun metodo sino ad ora utilizzabile consente di ridurre l’ampia variabilità di performance che esiste fra campioni, anche se della stessa specie, raccolti nella stessa località e contemporaneamente. Evidentemente esistono fattori di variazione individuale (dieta, fisiologia della digestione, tasso di sfaldamento delle cellule
intestinali, ecc. …) che influenzano le rese di PCR in maniera consistente. Non è quindi possibile indicare un singolo metodo che produca risultati significativamente e regolarmente migliori di altri, indipendentemente dalla specie. Tuttavia, probabilmente una maggioranza di studi indica che la dessicazione con silica o l’immersione in etanolo sono i due metodi più affidabili. Occorre ripetere due importanti considerazioni. Lo stato di campioni di feci essiccati in silica deve essere frequentemente monitorato. I campioni dessiccati possono reidratarsi in qualsiasi momento se sono sottoposti a fonti di umidità e se il silica si satura. Sono noti casi di campioni di escrementi di primati ed ungulati raccolti in Africa in zone a clima caldo e umido, perfettamente dessicati in silica, che sono arrivati ai laboratori in Europa completamente reidratati, ricoperti di muffe e pertanto del tutto inservibili. In alternativa, i campioni possono essere conservati in etanolo, che agisce come un dessicante poiché assorbe l’acqua dei campioni disidratandoli. L’azione dell’etanolo è volumetrica, pertanto un volume eccessivo di campione non può essere efficacemente disidratato. Per garantire la stabilità del DNA è essenziale che si rispettino rapporti volumetrici precisi, tipo 1 volume di campione in almeno 4-10 volumi di etanolo. L’etanolo può essere sostituito, per es., nei casi in cui assuma colorazioni che indicano la dissoluzione di pigmenti. Esistono metodi combinati di conservazione. Per esempio, le compagnie aeree rifiutano di accettare e spedire campioni biologici in etanolo (infiammabile). Perciò è possibile dessiccare e spedire i campioni in silica, poi trasferirli e conservarli in etanolo in
laboratorio. Anche nel caso dei campioni di escrementi, l’estrazione del DNA dovrebbe essere fatta appena possibile. Se non è possibile estrarre il DNA entro breve tempo (nella lontra, possibilmente entro una
settimana), prima di avviare i progetti NGS è opportuno fare esperimenti pilota di conservazione sul campo e di conservazione a lungo termine in laboratorio.
I campioni fecali di lontra devono essere raccolti freschissimi, la mattina presto per evitare degradazioni del DNA a seguito di una prolungata esposizione alle condizioni climatiche, meglio se dalla superficie degli escrementi utilizzando stuzzicadenti, o cucchiaini di plastica usa-e-getta, immediatamente deposti
singolarmente in provette con etanolo e congelati appena possibile. Sapendo che si usano circa 200 and 400 mg di materiale fecale per ogni estrazione, è sufficiente raccogliere circa 2 cm3 di ogni campione per ottenere materiale per diverse estrazioni di DNA. In questo modo, utilizzando provette contenenti 20 ml di etanolo, si rispetta un corretto rapporto volumetrico di 1:10. E’ noto che il DNA nei campioni di feci e gel anali di lontra degrada molto rapidamente. Quindi è assolutamente essenziale raccogliere campioni molto freschi, che siano stati deposti non oltre le 10-12 ore precedenti. Il campionamento NGS di escrementi di lontra pertanto deve essere effettuato come segue:
a) si effettuano sopralluoghi nelle aree (rive di fiumi o laghi) che presumibilmente ospitano popolazioni di lontra, e si identificano le aree di presenza certa della specie osservando la presenza di camminamenti, scivoli, orme, escrementi freschi o resti alimentari, costituiti di solito da squame o lische di pesce in vecchi escrementi; questi sopralluoghi possono essere effettuati da gruppi di operatori che percorrono congiuntamente lunghi tratti (30-40 km) di un corso idrico;
b) si delimitano le aree di campionamento, cioè tratti di riva lunghi circa 600 – 1000 metri, che vengono mappate identificando le coordinate geografiche, e descritte con precisione in apposite schede di campionamento;
c) la ricerca delle feci viene effettuata percorrendo a piedi le aree di campionamento, eventualmente camminando in acqua o utilizzando una piccola imbarcazione, perlustrando le due sponde, controllando i più probabili siti di marcamento quali massi affioranti dall’acqua ed eventuali isole al centro del fiume;
d) in ogni area di campionamento si effettua un sopralluogo serale che deve consentire l’identificazione precisa di tutti gli escrementi preesistenti, presumibilmente vecchi e quindi inutilizzabili per le analisi genetiche; questi escrementi sono eliminati, coperti con sassi o segnalati con rametti d’albero;
e) la mattina seguente (presto) si effettua la raccolta dei campioni ripercorrendo le aree di campionamento, raccogliendo e conservando in provette con etanolo esclusivamente gli escrementi freschi, che sono stati certamente deposti nel corso della notte precedente; queste sessioni di campionamenti dovrebbero essere ripetute con cadenza bimensile;
f) le provette contenenti ogni escremento devono essere identificate con precisione, numerate in maniera non ambigua, registrate nelle schede di campo e georeferite; è utile prendere fotografie dei campioni e delle aree di campionamento;
g) le provette i campioni in etanolo sono inviati entro una settimana dalla raccolta al laboratorio di
genetica che dovrà effettuare immediatamente le estrazioni del DNA; la spedizione dei campioni si farà tramite corriere o posta-celere; i campioni in etanolo sono stabili per breve tempo a temperatura
ambiente, ma, soprattutto nel caso della lontra, per minimizzare la degradazione del DNA è consigliabile comunque il congelamento a – 20°.
Conoscenze approfondite della biologia della specie e delle caratteristiche ambientali e climatiche delle aree di studio sono importanti per la migliore pianificazione delle attività di campionamento. Dopo un lungo
periodo di declino le popolazioni di lontra sono estinte nell’Italia settentrionale e nella maggior parte dell’Italia centrale. L’areale attuale comprende due aree disgiunte: un’area principale (Basilicata e parte della Campania, Puglia e Calabria) ed un’area di minor presenza della specie (Molise). I due areali non sono ancora ben delimitati ed ogni anno viene individuata la presenza della lontra in nuovi bacini fluviali. Sono stati effettuati alcuni limitati censimenti locali (utilizzando anche metodi di genetica non-invasiva) e stime globali della popolazione italiana di lontra, che tuttavia sono ancora molto approssimative. La lontra è specie territoriale che mostra un’intensa attività di marcamento, effettuata mediante la
deposizione di feci (spraints) che hanno dimensioni variabili, da piccoli frammenti a circa 8-9 cm di lunghezza. Le feci fresche hanno un colore nero-verdastro e sono ben idratate con forma talvolta cilindrica. Col tempo le feci si disidratano, assumono una colorazione biancastra, ma conservano l’odore caratteristico. Nelle feci sono spesso evidenti resti alimentari (scaglie e vertebre di pesci, frammenti ossei di anfibi e rettili, e porzioni del carapace di crostacei). La lontra marca il territorio usando anche il secreto delle ghiandole anali (gel), che si presenta come una macchia bruna e collosa, caratterizzato da un odore persistente come quello delle feci. La lontra generalmente marca siti ben evidenti, come sassi, rocce, ciuffi o cuscinetti d’erba lungo le rive di fiumi e laghi, o massi affioranti dall’acqua e piccole isole dei corsi d’acqua. Spesso marca in punti obbligati di passaggio, quali ponticelli, camminamenti e scivoli verso l’acqua. Spraints e gel possono ritrovarsi assieme o separatamente, isolati o raggruppati in siti di marcamento (sprainting site) del raggio di circa un metro, generalmente utilizzati in modo stabile da più individui. La metodica standard di
monitoraggio della presenza della lontra prevede l’individuazione di un certo numero stazioni rilevamento, costituite da tratti di fiume di lunghezza compresa fra i 600 e 1000 m, da percorrere periodicamente
rilevando i segni di presenza della specie (orme, feci e gel). Queste stazioni sono utilizzabili come aree per il campionamento non-invasivo. L’intensità di marcamento, e quindi la probabilità di raccogliere campioni biologici, varia nell’arco dell’anno con picchi in primavera ed autunno. Nella pianificazione del
campionamento è importante tener conto degli andamenti climatici locali che determinano le fluttuazioni dei regimi fluviali (in periodi di piena o di acqua alta le rive possono essere inaccessibili e le feci possono venire dilavate), o lo stato della vegetazione sulle rive (l’erba alta può rendere difficoltosa l’individuazione delle feci). In Bibliografia si citano i principali lavori pubblicati di genetica non-invasiva e di genetica delle popolazioni di lontra.
I campioni biologici possono essere raccolti in modo occasionale durante le ricerche di campo. I campionamenti occasionali tuttavia non consentono di valutare la freschezza dei campioni. La scarsa quantità e qualità del DNA diminuisce il successo delle genotipizzazioni, introduce errori che possono compromettere i risultati delle analisi genetiche. Le procedure di NGS devono sviluppare protocolli di qualità che consentano di minimizzare gli errori di genotipizzazione e produrre dati che siano adeguati a rispondere alle domande poste dal progetto. Prima di iniziare il campionamento è pertanto necessario stabilire quali sono i risultati che si vogliono raggiungere. Se lo scopo, ad esempio, è il conteggio della popolazione sarà necessario definire in anticipo uno schema di campionamento basato sui metodi di cattura e ricattura; se invece lo scopo è quello di studiare la dinamica della popolazione è necessario effettuare uno sforzo di campionamento prolungato nel tempo per poter includere più generazioni di animali. Lo schema di campionamento sopra delineato dovrà essere adattato: 1) alle disponibilità di personale competente che può operare per certi periodi di tempo nelle aree di studio e che condiziona lo sforzo di campionamento; 2) alle condizioni geografiche, ambientali e climatiche locali, che condizionano l’accessibilità ai siti di
campionamento e le probabilità di raccogliere campioni; 3) agli obiettivi del progetto di studio, che
condizionano l’intera strategia di campionamento e determinano, se raggiunti, la qualità dei dati ed il tipo di informazione che dai dati si può ricavare. Possiamo descrivere, come esempio, due obiettivi e due schemi estremi di campionamento. Nel primo caso, l’ampiezza dell’area di studio, le scarse conoscenze disponibili sulla presenza della specie e la limitata disponibilità di personale, costringono a disegnare un progetto di tipo esplorativo che ha lo scopo di accertare la presenza della specie, contare il numero minimo di individui
presenti, ma non può aspirare ad ottenere una stima dell’abbondanza della popolazione. In questo caso gruppi di operatori effettuano congiuntamente sopralluoghi estensivi nelle aree di campionamento percorrendo lunghi tratti (alcune decine di km) di un corso idrico e raccogliendo esclusivamente quei campioni (georeferiti) che appaiono freschi. Probabilmente le rese di PCR saranno scarse, ma sarà possibile comunque identificare il numero minimo di individui presenti nell’area e nel periodo di studio. I dati ottenuti da progetti di questo tipo possono essere comunque elaborati e fornire indicazioni utili, quali: