La caratterizzazione del dispositivo microfluidico è stata necessaria per determinare l’andamento delle velocità in funzione dei flussi osservati, in modo da stabilire la velocità ideale con cui effettuare i test successivi, come definito nella sezione 2.1.13.
Sono stati registrati dei video relativi a flussi particellari aventi velocità diverse, focalizzando l’attenzione su tre aree principali del microcanale. L’analisi dei video è stata effettuata utilizzando dei programmi per l’elaborazione digitale delle immagini, Imagej® e Prana®. Osservando i risultati ottenuti per ogni area si può notare che, impostando lo stesso flusso sulla syringe pump, la velocità delle nanoparticelle ha un andamento costante in tutte le aree. Infatti analizzando, ad esempio, la velocità media ottenuta impostando la syringe pump a 0,05 mL/h si ricava un valore di 31,62 µm/s ± 2,264, mentre con un flusso di 0,10 mL/h la velocità media ottenuta è di 65,73 µm/s ± 6,128. L’andamento di questi risultati si riflette per tutti gli altri flussi e viene evidenziato in Figura 5.1, Figura 5.2 e Figura 5.3: dai grafici si nota infatti che il rapporto tra il flusso e la rispettiva velocità presenta un andamento lineare. Considerando che la velocità relativa al flusso di perfusione intestinale era di circa 33,3 µm/s, la velocità con cui condurre gli esperimenti successivi è stata determinata
38
utilizzando la retta di calibrazione generata al momento della caratterizzazione del microcanale. Per gli esperimenti è stato utilizzato un valore di 30 L/h.
Le linee di flusso delle particelle, generate attraverso il software Imagej®, mostrano traiettorie rettilinee riconducibili a un flusso di tipo laminare caratteristico del regime microfluidico, nel quale sono assenti turbolenze. È stato generato un flusso che aveva un andamento quasi perfettamente parallelo al muco, condizione necessaria per la simulazione del movimento di tipo longitudinale dell’acqua all’interno dell’intestino, condizione studiata qui per la prima volta.
3.6 Utilizzo del sistema microfluidico per lo studio della diffusione
particellare nel muco intestinale
Le prove sulla diffusione particellare nel muco intestinale sono state effettuate per i polimeri QA-Ch-fluoresceinato e QA-Ch-S-pro-fluoresceinato, e per le relative NP. L’analisi dei video registrati durante ogni esperimento è stata effettuata utilizzando il software Imagej®. Per ogni video sono state selezionate delle regioni di interesse (ROI) all’interno del punch contenente il muco, aventi la stessa area e situate alla stessa distanza tra loro (Figura 5.4). Per ogni ROI è stato misurato il mean gray value, cioè il valore medio della scala di grigi dei pixel contenuti all’interno di quelle aree, a vari frame del video in base al quale stabilire l’andamento dell’intensità del polimero in funzione del tempo. Mettendo in relazione il tempo intercorso per il raggiungimento del picco massimo di intensità per ogni ROI con la distanza presente tra una ROI e un’altra, sono state calcolate le velocità con cui i polimeri riuscivano a diffondere attraverso il muco. Per il polimero QA-Ch-S-pro fluoresceinato la velocità di penetrazione delle particelle all’interno del muco era di 14,287 µm/min ± 1,067 corrispondenti a 0,238 µm/s ± 0,017; le NP di QA-Ch fluoresceinato mostravano una velocità di 17,294 µm/min ± 6,536 corrispondenti a 0,288 µm/s ± 0,109.
39
I dati ottenuti sono stati paragonati a quelli espressi in letteratura [Mert, O., et al. (2012); Lai, S. K., et al. (2009)]: da alcuni studi sulla diffusione particellare attraverso il muco, effettuati con la tecnica del multiple particle tracking, sono stati ricavati i valori del mean
square displacement (MSD), ovvero la misura dello spostamento di una particella rispetto
ad una posizione d’origine nel tempo, e da questi sono stati estrapolati i valori relativi alla velocità di diffusione delle particelle. Si è visto che le velocità espresse in letteratura rientravano in un range tra 0,252 e 0,398 µm/s e le velocità ottenute attraverso il nostro studio erano di circa 0,238 µm/s per il polimero QA-Ch-S-pro e 0,288 µm/s per le NP QA- Ch. La differenza nelle velocità ottenute può essere riconducibile alle diverse caratteristiche di mucoadesione dei due polimeri, infatti il polimero S-protetto essendo più mucoadesivo presenta una velocità di penetrazione nel muco minore rispetto alle NP di QA-Ch.
Tra tutti gli esperimenti realizzati è stato possibile effettuare questa analisi solo nei due casi sopra citati (QA-Ch-S-protetto fluoresceinato e NP QA-Ch fluoresceinato) (Figure 5.5 e
5.6). Negli altri casi il muco tendeva a non rimanere stabilmente confinato all’interno del
punch. Ciò è probabilmente imputabile alle dimensioni troppo ampie della superficie di contatto tra il muco intestinale e il flusso, risolvibile in prospettiva con la fabbricazione di un dispositivo in cui la superficie di separazione tra il muco e il fluido sia controllata tramite apposite microstrutture.
La diffusione particellare attraverso il muco intestinale è stata valutata anche fluorimetricamente (fluorimetro Cary Eclipse) misurando l’intensità di fluorescenza delle dispersioni particellari in uscita dal microcanale (lunghezze d’onda utilizzate: eccitazione ʎ = 485 nm; emissione ʎ = 530 nm). Per confronto sono stati effettuati esperimenti analoghi a quello descritto, inserendo nel micronocanale tampone fosfato pH 6.8. Dai dati riportati in
Figura 5.7 si vede come le NP QA-Ch-S-pro, risultavano più mucoadesive rispetto alle NP
40
gruppi tiolici previene la loro ossidazione e consente una reazione di scambio tra gruppi tiolici protetti e i residui di cisteina dello strato di muco, portando alla formazione di ponti disolfuro tra NP e muco che si traduce in una forte interazione con il muco stesso.
41
4 CONCLUSIONI
Questo progetto di tesi ha portato allo sviluppo di un innovativo dispositivo microfluidico tramite il quale è stato possibile studiare per la prima volta la diffusione di NP attraverso il muco intestinale tenendo conto dell’influenza del movimento longitudinale dell’acqua. Nanoparticelle di adeguate dimensioni sono state ottenute mediante reticolazione ionotropica dei derivati del chitosano QA-Ch e QA-Ch-S-pro. Le dimensioni medie dei due tipi di NP erano comprese nell’intervallo 300-370 nm e il loro ZP era positivo, in accordo con la presenza di gruppi ammonici quaternari sulla loro superficie con nessuna differenza significativa tra i due tipi di NP.
Gli studi sulla diffusione dei polimeri e delle NP attraverso il muco intestinale sono stati effettuati grazie allo sviluppo di un dispositivo microfluidico all’avanguardia e hanno condotto a risultati promettenti: è stato possibile ricreare all’interno del microcanale un tipo di flusso che rispecchiasse il movimento dell’acqua longitudinale esistente all’interno dell’intestino; inoltre è stata determinata la velocità di perfusione dei polimeri all’interno del muco e i risultati ottenuti sono stati paragonabili a quanto espresso in letteratura; infine è stato possibile valutare il comportamento dei polimeri in presenza del muco, analizzando sia le velocità di perfusione sia i dati relativi alla concentrazione delle dispersioni particellari in uscita dal microcanale, confermando le aspettative relative alle loro caratteristiche di mucoadesione.
Per rendere il sistema ancora più efficiente ed agevolare gli studi sulla determinazione dell’influenza del movimento dell’acqua intestinale, in futuro potrebbero essere effettuate delle migliorie al chip microfluidico. La fabbricazione di un dispositivo in cui la superficie di separazione tra il muco e il fluido sia controllata tramite apposite microstrutture oppure l’implementazione del flusso trasversale dell’acqua permetterebbero, infatti, di ampliare e
42
migliorare l’acquisizione dei dati sullo studio della diffusione particellare attraverso il muco intestinale, i quali potrebbero essere sfruttati per orientarsi verso la progettazione di sistemi di rilascio farmacologici molto più efficienti.
43
5 FIGURE E TABELLE
Tabella 5.1 Grado di acetitalzione (GA), grado di sostituzione (GS), rapporto tra atomi di
azoto quaternari e terziari (n), grado di sostituzione dei gruppi tiolici (GS tioli) e densità di carica positiva (DC)a. Media ± DS di almeno 3 preparazioni.
Polimero GA (%± DS) GS (%± DS) n± DS DCa
QA-Ch 14.9±0,5 59,3±3,5 2,0±0,1 1,2
a numero di ioni ammonio quaternario per unità di ripetizione del polimero.
Tabella 5.2: Risultati dell’analisi iodometrica dei polimeri QA-Ch-SH e QA-Ch-S-protetto.
Media ± DS di almeno 3 preparazioni.
Polimero GSa Tioli[%] Contenuto in tiolo [μmol/g] GSa Disolfuro [%] Quantitativo di disolfuro [μmol/g] Contenuto di ligando legato [μmol/g] QA-Ch-SH 1,07 16,05 16,86 252,86 - QA-Ch-S- pro 0,53 7,98 34,8 521,6 66,3
a grado di sostituzione sulle unità di ripetizione del polimero.
Tabella 5.3: Caratteristiche delle NP studiate
Tipo di NP Dimensioni, nm ±DS PI±DS ZP ±DS mV NP QA-Ch fluoresceinato 334,32±28,35 nm 0,35±0,02 9,6 ± 2,1 NP QA-Ch-S-Pro fluoresceinato 369,40±1,13 nm 0,31±0,02 10,1±1.2
Figura 5.1: Risultati caratterizzazione area centrale :
a. grafico relativo alla velocità delle particelle rispetto al flusso; b. Particle Image Velocimetry (PIV) per ogni flusso analizzato; c. Linee di flusso delle particelle (Streamlines)
44 a.
45
c.
Figura 5.2: Risultati caratterizzazione area iniziale :
a. grafico relativo alla velocità delle particelle rispetto al flusso; b. Particle Image Velocimetry (PIV) per ogni flusso analizzato; c. Linee di flusso delle particelle (Streamlines)
46
b.
c.
Figura 5.3: Risultati caratterizzazione area finale :
a. grafico relativo alla velocità delle particelle rispetto al flusso; b. Particle Image Velocimetry (PIV) per ogni flusso analizzato; c. Linee di flusso delle particelle (Streamlines)
47 a.
48 c.
49
Figura 5.4: Rappresentazione esemplificativa delle ROI prima (a) e dopo (b) la diffusione
polimerica attraverso il muco.
a.
50
Figura 5.5: Risultati relativi al polimero QA-Ch-S-pro-fluoresceinato: a. andamento
dell’intensità di fluorescenza in funzione del tempo (esempio Riga A); b. tempo intercorso per il raggiungimento del picco massimo di intensità per ogni ROI e la distanza esistente tra esse; c. velocità media estrapolata.
a.
Tempo (min)
Distanza (µm)
Riga A
A1 21,875 0 A2 25,000 54,54 A3 29,167 109,09Riga B
B1 23,958 0 B2 25,000 54,54 B3 31,250 109,09Riga C
C1 23,958 0 C2 25,000 54,54 C3 30,208 109,09 b.µm/min
µm/s
Velocità media ± DS (A+B+C) 14,287±1,067 0,238±0,017 c. 0 50 100 150 200 250 300 0 2,083 4,167 6,250 8,333 10,417 12,500 14,583 16,667 18,750 20,833 22,917 25,000 27,083 29,167 31,250 33,333 35,417 In ten sità d i fl u o re sce n za Tempo (min)QA-Ch-S-pro-fluoresceinato
riga A A1 A2 A351
Figura 5.6: Risultati relativi alle NP QA-Ch-fluoresceinato: a. andamento dell’intensità di
fluorescenza in funzione del tempo (esempio Riga A); b. tempo intercorso per il raggiungimento del picco massimo di intensità per ogni ROI e la distanza esistente tra esse; c. velocità media estrapolata.
a.
Tempo (min)
Distanza (µm)
Riga A
A1 2,083 0 A2 9,375 127,27 A3 13,542 254,54Riga B
B1 2,083 0 B2 8,333 127,27 B3 13,542 254,54Riga C
C1 3,125 0 C2 10,417 127,27 C3 32,292 254,54 b.µm/min
µm/s
Velocità media ± DS (A+B+C) 17,294±6,54 0,288±0,11 c. 0 50 100 150 200 250 300 In ten sità d i fl u o re sce n za Tempo (min)Riga A
52
Figura 5.7: Risultati relativi all’analisi fluorimetrica: confronto tra le concentrazioni di NP
QA-Ch-S pro fluoresceinato e NP QA-Ch fluoresceinato (mg/mL).
0, 79 0,5 N P Q A - C H F L U O R E S C E I N A T O N P Q A - C H - S - P R O T E T T O F L U O R E S C E I N A T O
CONCENTRAZIONE (MG/ML)
53
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