IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
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Nel caso del Pz. 2, l’eluato della colonna IgG4 contiene, quasi esclusivamente, IgG4. Il FT, invece contiene elevati livelli di IgG1, come atteso, ma anche livelli notevoli di IgG4 che non sono state legate dalla colonna. Questo dipende dal fatto che il contenuto di IgG4 di partenza era molto elevato, di gran lunga maggiore della capacità di legame della colonna.
Le frazioni ottenute dal paziente 1 sono state utilizzate per un set di esperimenti volto a controllare in quale frazione di IgG si ritrovassero le immunoglobuline capaci di indurre produzione di IL-8 da parte dei HDF, di legare gli HDF in fluorescenza e di riconoscere proteine espresse dagli HDF mediante immunoblot.
La figura seguente mostra il grafico della produzione di IL-8 da parte di HDF stimolati con IgG totali o con le diverse sottoclassi di IgG purificate dal paziente con IgG4-RD (IgG4-RD 5). In questo paziente la frazione che induce maggior produzione di IL-8 è quella contenente esclusivamente IgG4. 0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0 1200,0 1400,0 1600,0 IL -8 ( n g/ m l)
IL-8
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Legame degli anticorpi a proteine espresse dai fibroblasti da derma
Per verificare in quale frazione risiedessero le immunoglobuline capaci di legare gli HDF in immunofluorescenza, abbiamo effettuato alcuni esperimenti con HDF fissati/permeabilizzati con metanolo/acetone e utilizzato le diverse sottoclassi di IgG purificate mediante cromatografia di affinità.
Come possiamo osservare le IgG4-RD IgG legano i gli HDF; l’analisi delle frazioni IgG4 e IgG1-2 mostra una fluorescenza debole ma presente, segno che Ig capaci di legare le cellule potrebbero essere presenti in entrambe le frazioni
Al fine di caratterizzare le proteine espresse dai fibroblasti da derma e riconosciute dagli anticorpi abbiamo effettuato un lisato totale di fibroblasti biotinilati sulla superficie e abbiamo effettuato poi degli esperimenti di immunoblot con gli anticorpi purificati.
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Il lisato di HDF è stato separato su SDS-PAGE, trasferito su PVDF, tagliato in strip e le diverse frazioni di Ig da pazienti e dai soggetti di controllo (NH) sono state incubate sulle strip. Una delle strip è stata incubata con neutravidin-HRP, per evidenziare le proteine biotinilate e quindi espresse sulla membrana degli HDF.
La figura seguente mostra i risultati ottenuti in un esperimento.
Come si osserva in figura, la neutravidin riconosce diverse proteine in un range di peso molecolare compreso tra 30 e 80 KDa, oltre a marcare proteine di circa 22 KDa () .
Ci sono alcune proteine che vengono legate da tutte le frazioni utilizzate (NH o IgG4-RD).
Due proteine (indicate con le frecce ) di peso molecolare di circa 30 KDa e 67 KDa) vengono, invece, riconosciute solo dal paziente IgG4-RD3 e in particolar modo dalla frazione di IgG4 purificate; il peso di queste proteine è compatibile con quello delle proteine riconosciute dalla neutravidina, il che suggerisce che potrebbero essere proteine biotinilate e quindi espresse sulla membrana. Sarà necessario effettuare esperimenti di immunoprecipitazione con le IgG4 purificate e successivo legame con la neutravidina per poter confermare che gli anticorpi legano proteine biotinilate esposte sulla membrana.
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6. CONCLUSIONI
La patogenesi della malattia da IgG4 è tuttora poco chiara. L’aumento dei plasmablasti circolanti, correlato con l’attività di malattia e la risposta alla terapia, l’infiltrato infiammatorio ricco di plasmacellule negli organi colpiti, l’aumento delle IgG4 nel sangue suggeriscono che le cellule B e gli anticorpi abbiano un ruolo importante nella malattia. Poiché fino ad ora non sono stati dimostrati autoanticorpi associati alla malattia, che possano avere un ruolo nell’induzione del danno d’organo, la visione prevalente è che le cellule B siano rilevanti come cellule presentanti l’antigene che consentono l’espansione di cloni T patogeni [8].
In questo lavoro di tesi abbiamo invece esplorato l’ipotesi che nel siero dei pazienti con malattia da IgG4 siano presenti autoanticorpi, anche appartenenti alla sottoclasse IgG4. Gli esperimenti da noi effettuati suggeriscono che le IgG presenti nel siero di pazienti con IgG4-RD leghino i fibroblasti e inducano la produzione di IL-8.
Gli esperimenti di immunofluorescenza ed immunoblot suggeriscono che il legame degli anticorpi alle cellule sia prevalente ma non esclusivo della frazione di IgG4 purificate; infatti anche le IgG1- 2, presenti nel flow through della colonna per la purificazione delle IgG4, legano gli HDF sia su vetrino che in immunoblot.
Risultati analoghi, consistenti con l’ipotesi che gli autoanticorpi non siano esclusivamente IgG4, sono stati ottenuti in uno studio che ha valutato la patogenicità degli anticorpi IgG ottenuti da soggetti con malattia da IgG4 attraverso la somministrazione degli anticorpi a topi neonati [17]. La somministrazione sottocute di anticorpi IgG a topi neonati ha determinato l’insorgenza di lesioni pancreatiche e salivari, caratterizzate da necrosi cellulare con abbondante infiltrato infiammatorio. Incubando le IgG con sezioni di tessuto pancreatico, gli autori hanno dimostrato il legame degli anticorpi ad antigeni della membrana basale e della matrice extracellulare, non ancora identificati. L’effetto patogeno in vivo ed il legame al tessuto in vitro erano entrambi ottenibili sia con la frazione IgG4 (da tutti i pazienti studiati) che in molti casi con la frazione IgG1. Gli autoanticorpi sembrano essere, quindi, sia IgG4 che IgG1 nella maggior parte dei pazienti; in una minoranza dei casi appartengono solo alla sottoclasse G4.
Anche nel nostro caso la natura e la distribuzione dell’antigene legato dagli anticorpi sui fibroblasti non è nota. Gli esperimenti di immunofluorescenza, finora condotti su cellule fissate e permeabilizzate, devono essere ripetuti su cellule fissate ma non permeabilizzate, per verificare l’espressione dell’antigene sulla membrana cellulare o invece all’interno della cellula.
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Anche l’utilizzazione del lisato di HDi marcati in superficie potrà consentire di ottenere informazioni importanti sulla natura e la localizzazione dell’antigene. Infatti, le IgG purificate possono essere utilizzate per immunoprecipitare le proteine presenti nel lisato di HDF biotinilati in superficie. I complessi antigene-anticorpo isolati con proteina G possono essere frazionati su SDS- PAGE e analizzati in Western blotting con la neutravidin-HRP. Se la neutravidin riconoscerà delle bande specifiche, le proteine immunoprecipitate dagli anticorpi risulteranno essere originariamente esposte sulla membrana.
Pur essendo ancora sconosciuta la natura dell’antigene dei fibroblasti che è riconosciuto dagli anticorpi di pazienti con malattia da IgG4, la capacità degli anticorpi di indurre la produzione di IL- 8 sembra molto rilevante nella patogenesi della malattia.
IL-8 o CXCL8 è una chemochina pro-infiammatoria multi-funzionale inizialmente identificata per la sua attività chemotattica sui neutrofili ; in seguito è stato dimostrato che numerosi tipi di cellule possono produrre IL-8, che a sua volta agisce su molti bersagli e non solo sui neutrofili [18].
A seguito di adeguati stimoli, IL-8 può essere liberata da monociti/macrofagi, cellule endoteliali, T linfociti, fibroblasti, cellule epiteliali. I recettori di IL-8, CXCR1 e CXCR2, sono a loro volta espressi su molti tipi di leucociti, su neutrofili, monociti, T CD8+, mastociti, basofili, cellule natural killer. L’attivazione di CXCR1 e CXCR2 sui leucociti induce chemiotassi e influsso di calcio; nei neutrofili viene anche stimolata la liberazione dei granuli e la generazione di specie reattive dell’ossigeno. Oltre ai leucociti, esprimono CXCR1 e CXCR2 anche cheratinociti, fibroblasti, neuroni, cellule epiteliali, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, epatociti e melanociti. Grazie alla sua attività sulle cellule endoteliali, IL-8 è un potente induttore di angiogenesi.
Oltre a queste funzioni, l’IL-8 potrebbe giocare un ruolo importante anche nell’induzione di fibrosi. Infatti è stata dimostrata una correlazione tra l’aumento di produzione di IL-8 tissutale e circolante ed i livelli di fibrosi in patologie epatiche [19, 20].
Nella fibrosi polmonare idiopatica, malattia caratterizzata da eccessiva deposizione di collagene nelle pareti alveolari e nell’interstizio polmonare, sono stati trovati aumentati livelli di IL-8 nelle vie aeree, associati ad infiltrato neutrofilico e all’attività della malattia [21,22].
Inoltre, alcuni autori [23], hanno osservato che i livelli di IL-8 sierici correlano con il grado di fibrosi presente in pazienti con atresia delle vie biliari ed hanno suggerito che la produzione di tale chemochina possa essere responsabile della patogenesi della fibrosi.
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Infine, numerosi studi [24]. riportano che la IL-8, attraverso l’induzione dell’espressione di alpha- SMA, possa agire direttamente come chemochina pro fibrotica, promuovendo la differenziazione a miofibroblasti.
E’ quindi ipotizzabile che le IgG dei pazienti con IgG4-RD, inducendo la produzione da parte dei fibroblasti di IL-8, ne inducano anche contemporaneamente il differenziamento in termino pro- fibrotici. In parallelo, la produzione di IL-8 può essere responsabile dell’infiltrato infiammatorio che si osserva negli organi colpiti dalla malattia da IgG4.
Gli studi in corso oltre a verificare se le IgG purificate dai pazienti legano la superficie cellulare ed identificare le proteine riconosciute, cercheranno di chiarire il ruolo dell’IL-8 prodotta dai fibroblasti stimolati con IgG da IgG4-RD nel differenziamento verso mio-fibroblasti e nella induzione di fibrosi.
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7. BIBLIOGRAFIA
1. Stone JH, IgG4-related disease: pathophysiologic insights drive emerging treatment approaches, Clinical and Experimental Rheumatology, 2016;34 (Suppl. 98):S00-S00.
2. Stone JH, Zen Y, Desphande V, IgG4-Related Disease, The New England Journal of Medicine, 2012;366:539-551.
3. Martínez-Valle F et al, IgG4-related disease: Evidence from six recent cohorts, Autoimmunity Reviews, 2016.
4. Brito-Zerón P et al, The clinical spectrum of IgG4-related disease, Autoimmunity Reviews, 2014;143:1203-1210.
5. Okazaki K, Uchida K, Autoimmune Pancreatitis The Past, Present, and Future, Pancreas, 2015;44:1006–1016.
6. Mahajan VS et al, IgG4-Related Disease, Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 2014;9:315–347.
7. Mattoo H et al, Clonal expansion of CD41 cytotoxic T lymphocytes in patients with IgG4-related disease, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2016.
8. Della Torre E, Lanzillotta M, Doglioni C, Immunology of IgG4-related disease, Clinical & Experimental Immunology, 2015;181[2]:191–206.
9. Stone JH et al, Diagnostic Approach to the Complexity of IgG4-Related Disease, Mayo Clinic Proceedings, 2015;90:927-939.
10. Stone JH, IgG4-related disease: nomenclature, clinical features, and treatment, Seminars in Diagnostic Pathology, 2012;29:177-190.
11. Khosroshahi A, Stone JH, Treatment approaches to IgG4-related systemic disease, Current Opinion in Rheumatology, 2011;23: 67–71.
52
12. Koch AE, Distler O, Vasculopathy and disordered angiogenesis in selected rheumatic diseases: rheumatoid arthritis and systemic sclerosis, Arthritis Research & Therapy, 2007; 9 Suppl 2:S3.
13. Szekanecz Z et al, New insights in synovial angiogenesis, Joint Bone Spine, 2010;77[1]:
14. Gao X, Xu Z, Mechanisms of action of angiogenin, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2008:619-624.
15. Ohta N, Expressions a/nd Roles of Periostin in Otolaryngological Diseases, Allergology International, 2014;63:171-180.
16. Takano K et al, Recent advances in knowledge regarding the head and neck manifestations of IgG4-related disease, Auris Nasus Larynx, 2016.
17. Shiokawa M, Kodama Y, Kuriyama K, Yoshimura K, Tomono T, Morita T, Kakiuchi N, Matsumori T, Mima A, Nishikawa Y, Ueda T, Tsuda M, Yamauchi Y, Minami R, Sakuma Y, Ota Y, Maruno T, Kurita A, Sawai Y, Tsuji Y, Uza N, Matsumura K, Watanabe T, Notohara K, Tsuruyama T, Seno H, Chiba T. Pathogenicity of IgG in patients with IgG4-related disease. Gut. 2016;65(8):1322-32.
18. Russo RC, Garcia CC, Teixeira MM, Amaral FA. The CXCL8/IL-8 chemokine family and its receptors in inflammatory diseases. Expert Rev Clin Immunol. 2014 May;10(5):593-619.
19. Mahmood S, Sho M, Yasuhara Y et al. Clinical significance of intrahepatic interleukin-8 in chronic hepatitis C patients. Hepatol.Res. 2002; 24: 413–9.
20. Asselah T, Bieche I, Laurendeau I et al. Liver gene expression signature of mild fibrosis in patients with chronic hepatitis C. Gastroenterology 2005; 129: 2064–75.
53
21. Carre PC, Mortenson RL, King TE Jr et al. Increased expression of theinterleukin-8 gene by alveolar macrophagesin idiopathic pulmonary fibrosis. A potentialmechanism for the recruitment andactivation of neutrophils in lung fibrosis. J Clin Invest 1991;88(6):1802-10
22. Car BD, Meloni F, Luisetti M, Semenzato G, Gialdroni-Grassi G, Walz A . Elevated IL-8 and MCP-1 in the bronchoalveolar lavage fluid of patients with idiopathic pulmonary fibrosis and pulmonary sarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med 1994;149(3 Pt 1):655-9
23. Nobili V, Marcellini M, Giovannelli L et al. Association of serum interleukin-8 levels with the degree of fibrosis in infants with chronic liver disease. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2004; 39: 540–4.
24. Schauer IG, Ressler SJ, Tuxhorn JA, Dang TD, Rowley DR. Elevated epithelial expression of interleukin-8 correlates with myofibroblast reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Urology 2008; 72: 205–13.