Confrontando l’induzione di revertenti in TA100 (Fig 7.) da parte dei diversi composti, si possono distinguere tre gruppi:
Gruppo I – induzione di un alto numero di revertenti già alla dose più bassa. L’andamento a “campana”, peraltro presente anche in WSP934, è indicativo di un forte effetto tossico.
Gruppo II – alta induzione di revertenti anche se la dose più bassa risulta meno efficace rispetto al gruppo I. Tale comportamento si osserva anche per il composto leader. Alle dosi successive si rileva un incremento del numero di revertenti senza particolare tossicità.
Gruppo III – Il potenziale mutageno risulta molto ridotto rispetto a WSP934. Effetti significativi si osservano solo per dosi relativamente alte.
Me: metilico; Et: etilico Bu: butilico Bn: benzilico
Composto Struttura Gruppo
WSP1342 -CH2CH2CH3 I WSP1343 -CH(CH3)2 I WSP1344 -CH2CH2CH2CH3 I WSP1364 -CH2CH2CO2H III WSP1365 -CH2CH2CH2CO2H III WSP1367 -CH2CH2CO2Et II WSP1368 -CH2CH2CO2Bn II WSP1369 -CH2CH2CH2CO2Bn I WSP1370 -CH2CH2CH2CO2Et II WSP1372 -CH2CH2CH2OSi(Ph)2tBu II WSP1374 -CH2CH2CH2OCOMe II WSP1393 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2H III WSP1394 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2Me II WSP1396 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2Bn II
Fig.7. Induzione di revertenti in TA100 ± S9 e TA100NR da parte dei diversi derivati di WSP934, suddivisi in gruppi in base al loro potenziale mutageno (I: alto; II: medio; III: basso). Per ciascun composto è riportata la catena laterale che sostituisce l’idrogeno amminico di WSP934
Analizzando l’attività in relazione alla struttura, si può affermare che:
La sostituzione dell’idrogeno del gruppo amminico di WSP934 con una catena acido-carbossilica (WSP1364, WSP1365, WSP1393) porta ad un minor effetto su Salmonella. L’allungamento della medesima aumenta l’induzione di revertenti (WSP1393 rispetto a WSP1364 e WSP1365).
La sostituzione con una catena alifatica (WSP1342, WSP1343, WSP1344) aumenta la mutagenicità del composto e la sua tossicità. La biforcazione della catena (WSP1343) aumenta ulteriormente l’efficacia biologica.
La sostituzione dell’idrogeno terminale nella catena alifatica con un gruppo etere (WSP1372 e WSP1374) diminuisce relativamente poco l’attività mutagena rispetto a WSP934 mentre annulla gli effetti tossici.
La sostituzione dell’idrogeno terminale della catena acido-carbossilica con un gruppo Me, Et, Bu o Bn comporta un aumento del numero di revertenti (WSP1394 e 1396 rispetto a WSP1393, ma anche WSP1367, 1368 e 1370 rispetto a tutti quelli del gruppo III).
Se il gruppo sostituente è un gruppo benzilico anziché etilico l’attività mutagena è maggiore (WSP1368 > WSP1367 e WSP1369 > WSP1370).
Il composto WSP1369, che presenta una catena laterale acido-carbossilica a 4C con sostituzione dell’idrogeno terminale con un gruppo benzilico, è quello che induce i maggiori effetti biologici. Sia l’accorciamento (WSP1368, 3C) sia l’allungamento (WSP1396, 6C) portano ad una riduzione di tali effetti.
5.2.2. Idrossilazione
Per valutare l’effetto attivante/metabolizzante del complesso del citocromo P450, si è proceduto a valutare la percentuale residua di revertenti/unità di dose nel ceppo TA100 in presenza di S9 rispetto al medesimo ceppo in assenza di attivazione metabolica. A tale scopo sono state calcolate le rette di regressione per ciascun composto in È stata calcolata la differenza tra i due coefficienti angolari, indicativi dell’induzione di revertenti/unità di dose, e valutato il residuo percentuale rispetto all’incremento di revertenti in assenza di S9. I dati così ottenuti sono stati riportati nel grafico a barre in Salmonella con/senza S9 nella porzione lineare della curva dose-risposta. (Fig. 8)
Fig 8. Metabolizzazione dei composti da parte di S9. Sono riportati i residui percentuali dell’induzione di revertenti/unità di dose in TA100 in presenza di S9. I: basso residuo di revertenti, i.e. detossificazione del composto ad opera di S9; II: residuo medio ; III: cospicuo residuo di revertenti in presenza
di S9, i.e. scarsa
detossificazione.
Anche in questo caso sono stati individuati tre diversi gruppi di composti rispetto a WSP934: un gruppo (I) di composti che sono fortemente detossificati, un altro (II) con
TA100+S9 III II I 0 20 40 60 80 100 WS P93 4 WS P13 68 WS P13 69 WS P13 94 WS P13 96 WS P13 42 WS P13 43 WS P13 67 WS P13 70 WS P13 72 WS P13 93 WS P13 44 WS P13 74 Campione R e v e rt e n ti r e s id u i (% )
un comportamento abbastanza analogo a quello del composto leader, e infine un ultimo (III) con composti scarsamente alterati da S9 nella loro attività biologica.
Tabella 1. Relazione tra struttura della catena laterale sostituente l’idrogeno amminico di WSP934 e efficacia della detossificazione ad opera di S9 in TA100. Sono riportati i residui percentuali dell’induzione di revertenti/unità di dose in TA100 in presenza di S9. I composti sono suddivisi in gruppi in base al residuo potenziale mutageno in TA100 in presenza di S9 (I: basso; II: medio; III: alto).
Composto Struttura Mutagenicità residua Gruppo
WSP934 -H 39.58 - WSP1374 -CH2CH2CH2OCOMe 79.31 III WSP1372 -CH2CH2CH2OSi(Ph)2tBu 44.44 II WSP1344 -CH2CH2CH2CH3 73.87 III WSP1342 -CH2CH2CH3 49.06 II WSP1343 -CH(CH3)2 37.96 II WSP1367 -CH2CH2CO2Et 48.28 II WSP1368 -CH2CH2CO2Bn 12.73 I WSP1370 -CH2CH2CH2CO2Et 40.35 II WSP1369 -CH2CH2CH2CO2Bn 8.66 I WSP1393 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2H 33.33 II WSP1396 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2Bn 10.81 I WSP1394 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2Me 8.89 I
L’analisi struttura-attività evidenzia (Tabella 1):
Dal confronto con WSP934, i composti con catena acido-carbossilica come sostituente l’idrogeno amminico del composto leader risultano mediamente più detossificati (≈ 1/4) da parte di S9, in particolare quelli dove l’idrogeno terminale della catena laterale è stato sostituito con un gruppo benzilico o metilico (rispettivamente WSP1396 e WSP1394 verso WSP1393) ma non etilico (WSP1369 vs WSP1370 e WSP1368 vs WSP1367).
La sostituzione con una catena alifatica mediamente comporta una maggiore detossificazione rispetto a WSP934 da parte di S9. In particolare una catena più lunga (WSP1344, 4C) favorisce la detossificazione più di quanto osservato in WSP1342 (3C) e WSP1343 (3C con biforcazione).
I due eteri (WSP1374 e 1372) sono più detossificati di WSP934. Rispetto a WSP1342, si osserva una maggior detossificazione (≈2 volte) per uno dei suoi derivati (WSP1374) ma non per l’altro.
5.2.3. Nitroriduzione
Per valutare l’effetto della nitroriduzione dei composti sul loro potenziale mutageno, si è proceduto a valutare l’incremento percentuale dei revertenti/unità di dose nel ceppo TA100 rispetto al ceppo nitroreduttasi deficiente (TA100NR). A tale scopo sono state calcolate le rette di regressione per ciascun composto nei due ceppi in assenza di S9 nella porzione lineare della curva dose-risposta. È stata calcolata la differenza tra i due coefficienti angolari, indicativi dell’induzione di revertenti/unità di dose, e valutato l’incremento percentuale in TA100 rispetto a quello in TA100NR. I dati così ottenuti sono stati riportati nel grafico a barre in figura 9 in tre gruppi in relazione all’incremento del potenziale mutageno (I: forte dipendenza dal processo di riduzione del nitrogruppo; II: dipendenza media; III: la nitroriduzione non aumenta l’induzione di revertenti).
Fig 9. Nitroriduzione dei composti. Sono riportati gli incrementi percentuali dell’induzione di revertenti/unità di dose in TA100 rispetto a TA100NR. I: cospicuo aumento di revertenti a seguito del processo nitroreduttivo; II:
aumento medio ; III: incremento ridotto di revertenti, i.e. meccanismi alla base della mutagenicità del composto svincolati dal processo di riduzione del nitrogruppo.
TA100 III II I 0 100 200 300 400 500 600 WS P93 4 WS P13 68 WS P13 69 WS P13 70 WS P13 74 WS P13 93 WS P13 94 WS P13 42 WS P13 43 WS P13 44 WS P13 96 WS P13 67 WS P13 72 Campione In d u zi o n e r e v e rt e n ti d a n it ro ri d u zi o n e ( % )
Composto Struttura Mutagenicità indotta Gruppo WSP934 -H 8 - WSP1374 -CH2CH2CH2OCOMe 314 I WSP1372 -CH2CH2CH2OSi(Ph)2tBu 2 III WSP1344 -CH2CH2CH2CH3 226 II WSP1342 -CH2CH2CH3 165 II WSP1343 -CH(CH3)2 202 II WSP1367 -CH2CH2CO2Et 4 III WSP1368 -CH2CH2CO2Bn 358 I WSP1370 -CH2CH2CH2CO2Et 375 I WSP1369 -CH2CH2CH2CO2Bn 568 I WSP1393 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2H 500 I WSP1396 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2Bn 185 II WSP1394 -CH2CH2CH2CH2CH2CO2Me 463 I
Tabella 2. Relazione tra struttura della catena laterale sostituente l’idrogeno amminico di WSP934 e processo di nitroriduzione in TA100. Sono riportati gli incrementi percentuali dell’induzione di revertenti/unità di dose in TA100 rispetto al ceppo nitroreduttasi deficiente (TA100NR). I composti sono suddivisi in gruppi in base all’incremento del potenziale mutageno in TA100 in relazione alla riduzione del nitrogruppo (I: alto; II: medio; III: basso).
L’analisi dei dati di mutagenicità in relazione al processo nitroreduttivo (Tabella 2) indica che:
La mutagenicità di WSP934 in Salmonella è pressoché indipendente dalla riduzione del nitrogruppo. Un comportamento simile si osserva in WSP1372 (l’etere con maggior ingombro sterico) e WSP1367 (catena acido carbossilica con sostituzione dell’idrogeno terminale con un gruppo etilico).
I due eteri mostrano un comportamento completamente differente: il potenziale mutageno di WSP1374 risulta maggiormente dipendente dall’attività nitroreduttasica rispetto a quello di WSP1372 (ingombro sterico del gruppo sostituente maggiore).
Generalmente i composti con catena laterale alifatica (WSP1342, 1343 e 1344) risultano meno dipendenti dall’attività nitroreduttasica di quelli con catena acido carbossilica.
Composti con catena acido carbossilica a parità di gruppo terminale sostituente mostrano una diversa dipendenza dal processo di nitroriduzione in relazione alla numero di atomi di carbonio della catena acido carbossilica. Per i composti con gruppo
carbonio (WSP1370, 4C, mostra incremento molto maggiore in TA100 di WSP1367, 3C). Lo stesso comportamento si osserva negli analoghi con il gruppo benzilico (WSP1369, 4C, maggiore di WSP1368, 3C). Tuttavia, almeno con il gruppo benzilico, un ulteriore allungamento della catena (WSP1396, 6C) riduce l’importanza della nitroriduzione nell’indurre revertenti.
Nei composti con catena laterale acido carbossilica, la presenza del gruppo benzilico comporta una maggiore dipendenza dalla nitroriduzione rispetto ai corrispondenti composti sostituiti con un gruppo etilico (WSP1369 > WSP1370 e WSP1368 >> WSP1367).
In presenza di una catena laterale acido carbossilica a 6C, è presente una relazione inversa tra ingombro sterico del sostituente terminale (H, Me e Bn) e importanza della riduzione del nitrogruppo per l’induzione di revertenti, i.e. WSP1393 (H) > WSP1394 (Me) > WSP1396 (Bn).
In definitiva, nei composti con catena laterale acido carbossilica, l’importanza del processo di nitroriduzione appare regolata dalla lunghezza della catena acido carbossilica e contemporaneamente dall’ingombro sterico del sostituente terminale. In particolare si osserva che, affinché aumenti la dipendenza della mutagenicità del composto dalla riduzione del nitrogruppo, tanto più corta (3C) è la catena tanto maggiore deve essere l’ingombro sterico del gruppo terminale, i.e. WSP1368 >> WSP1367, e, viceversa, tanto più lunga la catena (6C) minore dovrà essere l’ingombro sterico del gruppo sostituente, i.e. WSP1393 (H) > WSP1394 (Me) > WSP1396 (Bn).
RISULTATI
Dai dati ottenuti relativi ai composti analizzati in questo studio possono essere tratte alcune osservazioni generali:
l’azione mutagena si esplica essenzialmente a livello di sostituzione piuttosto che inserzione/delezione di basi;
il processo di idrossilazione operata dal complesso del citocromo P450 (mix S9) generalmente detossifica anche se l’efficacia è fortemente dipendente dalla struttura del composto stesso;
la riduzione del nitrogruppo risulta fortemente legata all’azione mutagena solo in alcuni dei composti in esame, suggerendo così altri possibili meccanismi di interazione con il DNA (ad es. danno ossidativo piuttosto che alchilazione).
In particolare, per il composto leader WSP934 risulta che:
l’attività mutagena è essenzialmente legata alla porzione nitrofuranica;
il nitrogruppo risulta essenziale per l’attività della molecola anche se la nitroriduzione non aumenta il potenziale mutageno del composto.
Per quanto riguarda i composti derivati, sono evidenti alterazioni della capacità di indurre revertenti in relazione ai diversi sostituenti dell’idrogeno amminico di WSP934. Di seguito sono riportate alcune osservazioni in base alle caratteristiche principale del sostituente in comparazione con WSP934.
Catena alifatica
o maggior mutagenicità e tossicità;
o maggiore capacità di detossificazione da parte di S9;
o maggiore dipendenza dalla riduzione del nitrogruppo anche se sono presenti altri meccanismi per l’induzione di mutazioni.
Catena acido carbossilica
o potenziale mutageno generalmente più basso; o minore tossicità
o la detossificazione da parte di S9 è maggiore o uguale;
o la riduzione del nitrogruppo è generalmente il meccanismo principale per l’induzione di mutazioni.
o la lunghezza della catena acido carbossilica e il sostituente terminale modulano fortemente il potenziale mutageno del composto
I dati ottenuti con Salmonella permettono di tracciare il profilo mutageno in relazione alla struttura della molecola, supportando così la costruzione di modelli SAR per disegnare nuovi composti a bassa attività mutagena.
6 Conclusioni: Necessità di nuovi farmaci
La Tripanosomiasi Umana Africana, più nota come malattia del sonno è una patologia tipica dei paesi in via di sviluppo per la quale mancano farmaci (o vaccini) efficaci, accessibili e facili da usare. “Dimenticata” perché, essendo confinate ad ambiti
geografici e sociali molto lontani dai paesi sviluppati, non è percepita come una minaccia diretta.
E’ necessario che la malattia sia diagnosticata presto affinché si abbiano buone probabilità di guarigione. I farmaci usati sono diversi e dipendono fondamentalmente dalla stadiazione della malattia, nella prima fase Pentamidina e Suramina, nella seconda fase Melarsoprol, Eflornitina e Nifurtimox, in grado di attraversare la barriera emato encefalica.
Questi farmaci sono insufficienti, datati, altamente tossici e in alcuni casi inefficaci poiché i parassiti hanno sviluppato forme di resistenza. Molto si sta cercando di fare in ambito di prevenzione e controllo della malattia, risulta perciò molto importante la lotta alla mosca tse-tse.
Di massima importanza è la ricerca di nuove molecole in grado di debellare la malattia. Il farmaco ideale per il trattamento di infezioni parassitarie dovrebbe essere efficace sia in fase acuta che cronica della malattia, accessibile al paziente, non richiedere il ricovero, non indurre resistenza nel parassita, essere privo di effetti collaterali ed essere efficace dopo pochi trattamenti
Attualmente l’attenzione è focalizzata sulla progettazione e sintesi di nuovi composti nitroeterociclo-melaminici che hanno alta attività tripanocida, ma risultano tossici per l’organismo ospite. Associando l’anello nitroaromatico a melamina, si dovrebbe incrementare la specificità d’azione del farmaco in T. brucei e ridurre la tossicità nell’ospite.
Purtroppo, lo sviluppo di nuove e affidabili molecole per rimpiazzare quelle che diventano inefficienti richiede tempi lunghi ed è scarsamente supportato. In risposta all’urgente bisogno di nuove cure è nata DNDi (Drugs for Neglected Diseases Initiative), organizzazione no-profit indipendente costituita nel 2003 dall’Istituto di ricerca Pasteur di Parigi e Medici Senza Frontiere (MSF). Questa collaborazione ha portato allo sviluppo di nuove associazioni farmacologiche a partire da farmaci in uso quali melarprosol-nifurtimox o nifurtimox-eflornitina (NECT), che costituiscono attualmente il trattamento di prima linea raccomandato dall’OMS.
Si stima che 55 milioni di persone nel mondo siano a rischio di contrarre la tripanosomiasi; se le possibilità di accesso al trattamento di queste malattie dipendesse
da una logica diversa da quella puramente commerciale molte vite potrebbero essere salvate.
La ricerca e lo sviluppo sul trattamento delle malattie contagiose, tipiche dei paesi poveri, è abbandonata dalle multinazionali farmaceutiche, per le basse rese. La produzione e la distribuzione dei farmaci obbediscono alla logica del mercato, il che li rende inaccessibili alla grande maggioranza dei malati dei paesi poveri. L’esempio dell’Eflornitina è didascalico. Dopo essere stata commercializzata dai laboratori Merrel Dow ad un prezzo molto elevato, la sua produzione è stata comunque interrotta a causa dello scarso rendimento.
Il diritto alla terapia è parte integrante del diritto alla salute, un diritto umano fondamentale, indipendente da sesso, età, credo religioso, convinzioni politiche, etnia e ceto di appartenenza.
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