1 INTRODUZIONE
1.1 Malattie dimenticate 1
1.2 Accesso alle cure sanitarie 2
1.3 Drugs for Neglected Diseases: DNDi 4
2 Tripanosomiasi Africana umana o Malattia del sonno 6
2.1 Ciclo biologico del parassita 7
2.2. Evoluzione della malattia 8
2.3 Gestione della Malattia 10
3 Terapie farmacologiche contro la Tripanosomiasi umana africana 12
3.1 Primo stadio d’infezione 123.2 Secondo stadio d’infezione 14
4 Prospettive future per la chemioterapia 16
4.1 Dal genoma del parassita al farmaco 16
4.2 Dal farmaco al parassita: possibili bersagli 17
4.3 Ricerca e sviluppo di nuove molecole ( Comet test, Test micronuclei, Test di reversione in Salmonella typhimurium ) 21
5 Analisi dei composti 26
5.1. La struttura del composto leader 40
5.2. Le catene laterali (potenziale mutageno, idrossilazione, nitroriduzione, risultati ) 42
6 CONCLUSIONI 49
1 INTRODUZIONE
1.1 Malattie dimenticate
Le «malattie dimenticate» (Neglected Tropical Diseases, NTD) sono patologie tipiche dei paesi in via di sviluppo dove ogni anno provocano diversi milioni di morti e per le quali mancano farmaci (o vaccini) efficaci, accessibili e facili da usare. Le popolazioni colpite sono le più povere del pianeta, quelle che vivono in condizioni di scarsissima igiene, di malnutrizione, di analfabetismo, spesso in situazioni di forte instabilità politica, e per le quali l’accesso ai servizi sanitari di base è difficile. Tali malattie possono essere, a ragione, definite “dimenticate” perché, essendo confinate ad ambiti geografici e sociali molto lontani dai paesi sviluppati, non sono percepite come una minaccia diretta e non coinvolgono alcun interesse militare, turistico o di sicurezza. Infine, non rappresentando un potenziale mercato, sono poco considerate nelle attività di Ricerca e Sviluppo (R&S) delle case farmaceutiche.
Statistiche stilate dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS, WHO) [http://www.who.int] indicano ad esempio che, in Congo, le infezioni parassitarie sono la causa maggiore di morte nell’uomo, dopo la tubercolosi. La valutazione attuale parla di 300mila casi e almeno 50mila morti ogni anno. Un individuo su dieci è affetto da una delle otto più importanti malattie tropicali: malaria, schistosomiasi (bilharziosi), filariasi linfatica (elefantiasi), oncocercosi, lebbra, tripanosomiasi Americana (malattia di Chagas), tripanosomiasi Africana (malattia del sonno) e leishmaniosi.
In particolare, le tripasonomiasi sono malattie umane causate da protozoi parassitari del genere Trypanosoma. Diverse specie di Trypanosoma causano malattie veterinarie ma solo due determinano malattia nell’uomo.
Nel Centro e Sud America, l’agente eziologico Trypanosoma cruzi determina la tripanosomiasi umana americana (mal di Chagas) mentre, nell’Africa sub-Sahariana, il
Tripanosoma brucei causa la tripanosomiasi umana africana o malattia del sonno.
Nonostante diano origine a patologie differenti, i due agenti eziologici presentano aspetti comuni: sono costituiti entrambi da cellule flagellate trasmesse da insetti vettori. Dapprima si ha una fase di moltiplicazione locale in prossimità del sito d’infezione
nell’organismo umano, seguita da una seconda fase caratterizzata dalla diffusione del parassita negli organi interni dove causa danni letali.
Il mal di Chagas viene trasmesso all'uomo da cimici alate della famiglia delle Triatomine che trovano generalmente rifugio nelle crepe del fango che costituisce i muri, dei tetti di frasche delle capanne e nelle fronde delle palme. Quando l’insetto si nutre del sangue di individui infetti, il parassita passa nel suo intestino dove si moltiplica. Mediante le feci infette di queste cimici, il tripanosoma può poi infettare un nuovo individuo quando viene a contatto con piccolissime lesioni della pelle.
Nella malattia del sonno, T. brucei viene trasmesso all'uomo mediante la puntura della mosca tse-tse (ordine Diptera, genere Glossina), un insetto ematofago grigio-marrone simile ad un tafano, che punge di giorno, riconoscibile per il modo a forbice con cui ripiega le ali quando è a riposo [Barrett et al., 2003; Stich et al., 2006].
1.2 Accesso alle cure sanitarie
Milioni di persone nei Paesi del Terzo Mondo non hanno accesso alle cure sanitarie, ai farmaci e ai vaccini.
La realtà è complessa: l’accesso alle cure sanitarie non si limita solo al prezzo dei farmaci, ma riguarda anche le infrastrutture sanitarie, la formazione del team medico (medici, infermieri, farmacisti) e il livello di istruzione che permette alla popolazione di comprendere le regole di igiene o l’importanza della cura. Nelle zone di campagna più arretrate sono ancora diffuse tradizioni e superstizioni che portano ad affidarsi allo stregone, allo sciamano, piuttosto che alla medicina. In alcuni casi però non resta altro, perché le possibilità di assistenza sanitaria sono concentrate solo nelle grandi città, quindi per rivolgersi a un medico bisogna percorrere enormi distanze. La cosa più grave comunque è il fatto che spesso in Africa i pazienti non utilizzano i farmaci poiché non hanno i soldi per acquistarli, date le condizioni di estrema povertà. Anche quando vengono loro forniti gratuitamente dalle organizzazioni umanitarie, spesso li rivendono per guadagnare qualcosa. In altri casi non sono in grado di seguire correttamente tutto il trattamento, per mancanza di informazioni e di assistenza sanitaria. Le vaccinazioni dei bambini per proteggerli da alcune malattie non sono sistematiche, poiché i Paesi non
hanno i mezzi né le strutture sanitarie necessarie e l’intervento dell’OMS e delle Organizzazioni umanitarie non è in grado di assicurare la copertura di tutto il territorio. E’inaccettabile che la mancanza di denaro si trasformi in mancanza assoluta di un semplice antibiotico o antimalarico. Ci sono malattie che le erbe e le radici non possono curare, ci sono superstizioni che possono far morire. I farmaci essenziali sono quelli che “soddisfano i bisogni della maggioranza della popolazione in materia di cure sanitarie e devono essere sempre disponibili in quantità sufficiente e sotto la forma farmaceutica appropriata”. Così vengono definiti i farmaci essenziali nella lista pubblicata dall’OMS per la prima volta nel 1977, e periodicamente aggiornata.
Ma nei paesi poveri imperversa la vendita di farmaci scaduti, sottodosati, a volte privi di principio attivo, talvolta tossici.
Art. 25 della Dichiarazione Universale dei Diritti dell’Uomo (1948) ‘La salute è un diritto’ ma nei paesi economicamente svantaggiati, in particolare in Africa ci pare dipenda solo dai soldi, quindi non è ancora un diritto, ma un privilegio.
L’ OMS definisce la salute come ‘uno stato di completo benessere fisico, mentale e sociale’. Se applichiamo questo concetto alla realtà africana, ci rendiamo conto che non
solo gli ammalati, ma anche altri milioni di persone non sono in uno stato di salute, di benessere, perché afflitti da povertà, scarsità di cibo e di acqua, analfabetismo, mancanza di assistenza, guerre.
1.3
DRUGS FOR NEGLECTED DISEASES: DNDi
Uno studio del 2006 evidenzia che dei 1556 nuovi farmaci approvati fra il 1975 e il 2004, solo 21 (1.3%) sono stati concepiti per curare le malattie tropicali e la tubercolosi, nonostante queste malattie rappresentino oltre l’11% del totale ( Chirac P, Torreele E.
Lancet. 2006 May 12; 1560-1561). Ciò è dovuto al fatto che le multinazionali
farmaceutiche ritengono poco economico investire sulle malattie tropicali: non ci sarebbe guadagno in Africa e negli altri Paesi in via di sviluppo, perché troppo pochi clienti sarebbero in grado di pagare le cure necessarie; quindi preferiscono investire per il mercato del mondo ricco e industrializzato, proponendo nuovi farmaci per soddisfare le sue richieste. E’ terribile pensare di curare l’obesità o la calvizie perché fanno guadagnare, e ignorare i bisogni di milioni di ammalati poveri.
DNDi è una organizzazione no-profit indipendente che opera nella R&S di prodotti innovativi per curare malattie “trascurate” come malaria, leishmaniosi, tripanosomiasi africana e americana.
DNDi è stata costituita nel 2003 dall’Istituto di ricerca Pasteur di Parigi e Medici Senza Frontiere (MSF) in collaborazione con cinque istituti di ricerca pubblici e privati (tra i quali la fondazione Osvaldo Cruz brasiliana, il Ministero della Salute della Malesia e il Consiglio indiano per le ricerche) in risposta all’urgente bisogno di nuove cure e all’assenza di una adeguata leadership pubblica per stimolare la R&S per le malattie ignorate.
Pazienti colpiti da malattie come la malattia del sonno sono costretti a sottoporsi a cure tossiche e pericolose, solamente per avere limitate possibilità di sopravvivenza.
Le cure per le persone colpite dalla Leishmaniosi viscerale continuano ad essere proibitive, e le cure per il morbo di Chagas inesistenti.
DNDi ha dimostrato attraverso il suo lavoro come una collaborazione su ricerca e sviluppo che sia innovativa e guidata dai bisogni produca farmaci adatti a pazienti affetti dalle cosidette “malattie dimenticate”.
DNDi ha sviluppato il più grande portafoglio di R&S della storia per potenziali nuove cure contro la malattia del sonno, la leishmaniosi viscerale e il morbo di Chagas, grazie al quale si sono ottenuti farmaci adeguati ai bisogni dei pazienti, prodotti da diverse case farmaceutiche, con la garanzia di prezzi competitivi e di quantitativi sufficienti.
Sebbene la situazione globale della R&S per le malattie dimenticate sia migliorata dal 2003, i bisogni delle vittime di queste malattie sono ancora largamente disattesi.
Stimolare l’innovazione e fornire cure efficaci e accessibili per malattie che colpiscono le popolazioni più povere e che non rientrano negli interessi di mercato rimane una sfida immensa per DNDi e i suoi partner, considerando l’assenza di finanziamenti sostenibili e prevedibili. I risultati ottenuti da DNDi dimostrano che quando la R&S è guidata dai bisogni dei pazienti diventa possibile creare strumenti medici adeguati e accessibili alle popolazioni povere più a rischio.
DNDi e altre partnership pubblico-privato tuttavia, non possono sostituire una forte leadership politica e un impegno da parte dei governi per garantire ai pazienti l’accesso a cure salvavita per le malattie dimenticate.
I governi devono fare di più per promuovere la ricerca contro malattie dimenticate che colpiscono milioni di persone.
2 TRIPANOSOMIASI AFRICANA UMANA O MALATTIA
DEL SONNO
I paesi dell'Africa sub-sahariana a rischio per la malattia del sonno sono 36; e in alcuni di essi (per esempio l'Angola, il Congo, l'Uganda, il Sudan) la tripanosomiasi si può definire epidemica (Fig. 1). La sua diffusione è limitata dalla presenza dell’insetto-vettore. Le stime dell’OMS evidenziano che 55 milioni di persone vivono in aree a rischio d’infezione. Ad esempio, nel
2005 l’incidenza era di un milione e mezzo di casi, con stime di 8.000 morti ogni anno.
La malattia si presenta con tre tipologie con caratteristiche epidemiologiche, cliniche e terapeutiche diverse in relazione alla dislocazione geografica: la “tripanosomiasi Africana dell’Est”,
trasmessa da T. brucei rhodesiense, la “tripanosomiasi Africana dell’Ovest”, da T.
brucei gambiense (più diffusa) e quella trasmessa da T. brucei brucei che infetta
principalmente animali selvatici e solo raramente l’uomo [Pepin e Meda, 2001; Stich et al.,2002; Barrett et al., 2003; Legros et al., 2002].
2.1 Ciclo biologico del parassita
I tripanosomi, protozoi flagellati (detti emoflagellati) della famiglia
Trypanosomatidiae, comprendono specie parassite di grande importanza per la salute umana e animale. Gli emoflagellati hanno cicli di vita dixeni che si svolgono tra vertebrati e insetti, che ne costituiscono i vettori. Il corpo cellulare è generalmente allungato, dotato di un grande nucleo diploide con un cariosoma centrale, di un singolo flagello, con o senza membrana ondulante. Questa origina da una tasca flagellare accanto alla quale vi è un accumulo di DNA extranucleare (cinetoplasto) che costituisce il genoma del singolo mitocondrio. La riproduzione è prevalentemente asessuata, con scissione longitudinale del corpo cellulare a partire dall’estremità opposta a quella del cinetoplasto.
T. brucei, durante il suo ciclo vitale, può assumere diversi morfotipi. Le forme assunte
sono dette:
- Promastigote: generalmente esocellulare, corpo cellulare allungato, cinetoplasto e flagello libero;
- Epimastigote: esocellulare, corpo cellulare allungato, forma nella quale si replica sessualmente nell’insetto vettore, cinetoplasto e tasca del flagello sistemati anteriormente e vicino al nucleo;
- Tripomastigote: esocellulare, corpo cellulare allungato, forma infettiva, cinetoplasto e tasca del flagello sistemati posteriormente al nucleo.
Il tripanosoma ha bisogno di un vettore per passare da un ospite definitivo all'altro. La mosca tse-tse (genere Glossina), è un insetto ematofago che si nutre del sangue degli ospiti definitivi, vive generalmente in zone umide e calde (corsi d’acqua, piantagioni di caffè, boscaglia in genere). Il vettore della tripanosomiasi dell’Est, Glossina morsitans, necessita di condizioni ecologiche meno rigide, che le permettono di vivere dalla savana alla boscaglia intorno ai corsi d’acqua, cioè in ambienti con caratteristiche tra loro molto differenti.
L’infezione del parassita può avvenire anche tramite trasfusioni, oppure da madre a figlio (anche se questa malattia nelle donne incinte provoca l’aborto, motivo per cui i bambini nati infetti sono pochi).
2.2. Evoluzione della malattia
Il ciclo vitale di T. brucei (Fig. 2) si compie nel vettore e in diversi ospiti vertebrati (uomo e altri mammiferi). Nell’uomo il parassita si moltiplica nel sangue e nelle ghiandole linfatiche ed è poi in grado di attraversare la barriera ematoencefalica e di invadere il sistema nervoso centrale. A differenza di T. cruzi, rimane sempre extracellulare, ma è in grado di evadere il sistema immunitario dell’ospite grazie a continui cambiamenti antigenici delle glicoproteine di superficie [Stich et al., 2003].
Fig. 2 Ciclo infettivo di T. brucei:
A- FASE UMANA 1) la puntura della mosca tse-tse inietta Tripomastigoti; 2) T. iniettato si accresce e viene trasportato in altri siti tramite il circolo sanguigno, 3) moltiplicazione del T. nei diversi fluidi: sangue, linfa e liquido spinale; 4) T. in sangue – diagnosi;
B- FASE MOSCA TSE-TSE 5) puntura della mosca Tse-Tse, tramite la quale si ha ingestione del parassita; 6) il T., nel circolo sanguigno si trasforma nella forma prociclica e poi si moltiplica tramite scissione binaria; 7)la forma prociclica del T. si trasforma in epimastigote; 8) Epimastigote si moltiplica alivello delle ghiandole salivari, successivamente si trasforma nel T. metaciclico.
Le due forme di tripanosomiasi si differenziano per la velocità di evoluzione e per l’intensità dei sintomi. In entrambe si distinguono due fasi, ma la tripanosomiasi dell’Est ha un’evoluzione rapida, portando in certi casi al decesso in meno di 3 anni, e viene definita “tripanosomiasi acuta”, mentre la tripanosomiasi dell’Ovest ha un’evoluzione più lenta (anche 6-8 anni) e viene definita “tripanosomiasi cronica”. Dopo 10-21 giorni dalla puntura da parte della mosca si può avere una lesione (il tripanoma) nel punto di inoculazione. È un rigonfiamento rossastro a volte doloroso, più frequente nella tripanosomiasi dell’Est. È dovuto alla replicazione locale del parassita nella pelle e nei tessuti circostanti che precede l'invasione del sangue.
La prima fase, che nella variante dell’Ovest dura dai 2 ai 5 anni, si distingue per la presenza del tripanosoma solo nel circolo sanguigno e linfatico. I sintomi che caratterizzano tale fase sono: febbricola per 1-2 settimane alternata a periodi di sfebbramento, mal di testa, tachicardia. In alcune regioni si può avere il tipico rigonfiamento dei linfonodi cervicali (segno di Winterbotton), molto utile nella diagnosi precoce, presente però solo nel 25% dei casi. Nella variante dell’Est questa fase è acuta e i sintomi sono molto più intensi: l’esordio è improvviso, con febbre alta, mal di testa, e interessamento di vari organi: alterazione della funzionalità epatica con ittero, alterazione dell’attività cardiaca, ingrossamento della milza. A volte, i pazienti muoiono già in questa fase per arresto cardiocircolatorio.
La seconda e ultima fase della malattia porta al decesso in circa un anno. È caratterizzata dall’invasione da parte del parassita del liquido cerebrospinale con interessamento del cervello. Il tripanosoma può essere rinvenuto sia nel circolo sanguigno e linfatico sia nel liquido cerebrospinale. L’evoluzione è lenta e progressiva: al dimagrimento fisico si accompagnano sintomi psichici (alterazioni del comportamento fino a vere e proprie psicosi acute e del ritmo sonno-veglia) e neurologici (tremori, difficoltà nel movimento delle gambe, paralisi dei nervi cranici, deviazione della bocca, alterazioni della sensibilità, abbassamento della soglia del dolore). Lo stadio più avanzato è caratterizzato da dimagrimento estremo (il paziente non sente più lo stimolo della fame e, quindi, non mangia più), faccia assente, indifferenza all'ambiente esterno fino ad arrivare al coma.
La tripanosomiasi è detta “malattia del sonno” perché questa fase clinica è caratterizzata da alterazioni del ritmo sonno-veglia provocate da un’encefalite e i pazienti dormono
per la maggior parte del tempo in qualunque luogo. La morte di solito sopravviene per denutrizione o per complicanze infettive.
Nella variante dell’Est questa fase può durare solo alcuni mesi e il passaggio dalla prima alla seconda fase è meno netto in quanto l'invasione del tripanosoma nel liquido cerebrale può avvenire anche precocemente.
Nei bambini si può avere un’evoluzione atipica molto più rapida con febbre alta e continua ed il precoce interessamento del sistema nervoso centrale. Le alterazioni del comportamento non sono molto evidenti, ma si arriva precocemente al coma [Enanga et al.,2002, Barrett et al., 2003; Legros et al., 2002].
2.3 Gestione della Malattia
Prevenzione e controllo
I mammiferi infettati costituiscono il serbatoio della malattia: le mosche tse-tse s'infettano quando pungono e succhiano il sangue di una persona o di un animale malato e al pasto successivo - di solito, almeno 48 ore dopo, - possono infettare una persona sana. Perciò, quanto più il soggetto infetto rimane senza trattamento, tanto più numerose sono le mosche che vengono infettate e che possono trasmettere la malattia. La prevenzione deve perciò avvenire su due fronti: evitare che le mosche pungano l’uomo e trattare precocemente le persone infette per evitare che agiscano da serbatoio.
Risulta perciò molto importante la lotta alla mosca tse-tse.
Non servono le zanzariere intorno ai letti perché la mosca tse-tse punge durante il giorno. Si possono usare metodi di controllo su vasta scala (disinfestazione con insetticidi da aerei o elicotteri, liberazione di maschi sterili) o su scala ridotta (sistemi specifici di cattura delle mosche, utilizzo di teloni blu - il colore che le attrae -, impregnati con insetticidi, disboscamento dei luoghi dove si effettua l'approvvigionamento dell'acqua). Diversi studi hanno dimostrato che i metodi del secondo tipo sono i più efficaci, a patto che tutta la popolazione collabori.
Diagnosi
Individuare i soggetti infetti, diagnosticando l’infezione il più precocemente possibile, è l’altro approccio necessario alla riduzione/prevenzione della malattia. Il controllo di tutti coloro che vivono in zone ad alto rischio viene approntato con una valutazione clinica dei linfonodi laterocervicali in associazione o meno ad indagini sierologiche specifiche (CATT, Card Agglutination Test for Trypanosomiasis). Ai soggetti positivi in uno di questi due esami viene fatto uno striscio di sangue per la ricerca diretta del parassita.
Nei soggetti nel cui sangue viene trovato il tripanosoma, considerati già nella prima fase della malattia, si prosegue l’iter diagnostico. Si pratica perciò una puntura lombare per prelevare alcune gocce di liquido cerebrospinale, su cui si ricerca ancora una volta il tripanosoma. I soggetti positivi anche a questo secondo esame possono considerarsi già nella seconda fase della malattia. Attualmente, il test più rapido e facile da eseguire in contesti difficili (in 20 minuti) è il TESTRYP-CATT, metodo di agglutinazione diretta effettuabile su carta plastificata e che non richiede vetreria di laboratorio, messo a punto, prodotto e distribuito dall'Istituto di Medicina Tropicale di Anversa [Barrett et al., 2002; Stich et al., 2006].
Nei paesi in cui sono state fatte campagne di prevenzione (ricerca attiva dei soggetti malati, cattura delle mosche, disboscamenti, impiego di insetticidi) il numero dei nuovi casi per anno si è drasticamente ridotto, ma, una volta sospeso il programma, si è avuto un ritorno delle mosche tse-tse con conseguente incremento del numero di nuovi casi.
3
TERAPIE
FARMACOLOGICHE
CONTRO
LA
TRIPANOSOMIASI UMANA AFRICANA
La sconfitta di questa malattia incontra diversi ostacoli legati sia alla natura stessa del tripanosoma sia a cause più specificamente socio-politico-economiche .
Il rivestimento glicoproteico del parassita può assumere caratteristiche diverse poiché sono presenti più di 100 geni codificanti versioni differenti del rivestimento stesso. Il parassita ha, di conseguenza, la capacità di assumere, tramite variazione antigenica, processi immuno-protettivi. Difficile, quindi, porre un limite alla diffusione di questa malattia con un semplice vaccino [Denise et Barrett, 2001].
I farmaci usati finora sono insufficienti, datati, altamente tossici e in alcuni casi inefficaci poiché i parassiti hanno sviluppato forme di resistenza.
E’ necessario che la malattia sia diagnosticata presto affinché si abbiano buone probabilità di guarigione. I farmaci usati sono diversi e dipendono fondamentalmente dalla stadiazione della malattia (nelle fasi avanzate è necessario l’impiego di farmaci in grado di attraversare la barriera emato-encefalica e raggiungere il parassita).
3.1 Primo stadio d’infezione
Questo stadio si distingue per la presenza del tripanosoma solo nel circolo sanguigno e linfatico, con eventuale interessamento epatico e/o cardiaco. Pentamidina e Suramina, già in uso da molti decenni, sono ancora i farmaci di elezione per le prime fasi della malattia.
Suramina
(Bayer):E’ una naftilammina solforata polianionica solubile in acqua e
somministrata per via endovenosa. Essendo altamente ionica (sei gruppi solforici fortemente acidi), non è in grado di oltrepassare la barriera emato-encefalica, perciò il suo spettro d’azione è ristretto alla prima fase d’infezione [Kaur et al., 2002]. Possedendo ben sei cariche negative, il farmaco è in grado di interagire, tramite interazioni di tipo elettrostatico, con diversi enzimi e lipoproteine, tra cui LDL
(lipoproteine seriche a bassa densità) per le quali i tripanosomi possiedono il recettore. Questo meccanismo è sfruttato per concentrare il complesso farmaco-LDL nel parassita tramite endocitosi mediata da recettore [Scotte et al., 1996; Hanau et al., 1996; Denise et al., 2001]. Suramina agisce come inibitore promiscuo di molti enzimi e recettori e, proprio per questa sua capacità di inibire bersagli multipli tuttora non si è sviluppata una resistenza significativa al farmaco. Effetti collaterali associati al farmaco possono essere ritardati nel tempo e fatali (danni renali, dermatiti esfoliative, agranulocitosi, anemia emolitica, itterizia e diarrea) o immediati come collassi, nausea, vomito, shock [Fries et Frairlamb, 2003; Bitton et al.,1995; Kaur et al., 2002].
Pentamidina
(Aventis): diamina aromatica(composto basico contenente due gruppi ammidici), fortemente protonata a pH fisiologico, che viene somministrata per via parenterale. Poiché non è in grado
di penetrare nel sistema nervoso centrale, è efficace solo nel trattamento della fase precoce. Il suo assorbimento è mediato dal trasportatore ammino-purinico P2 [Carter et al., 1995], ma il suo meccanismo d’azione non è ancora del tutto chiaro. Effetti collaterali riscontrati sono: ipotensione, danni a fegato, reni, pancreas e diabete [Fairlamb, 2003]. Pentamidina può essere utilizzata per infezioni da T. brucei
rhodesiense nel caso in cui ci siano controindicazioni all’uso della Suramina. [Frommel
and Balber, 1987; Fairlamb et al., 1992; De Koning, 2001; Matovu et al., 2003; Bray et al., 2003].
3.2 Secondo stadio d’infezione
Questa fase si caratterizza per l’estensione dell’infezione al sistema nervoso centrale (SNC), e prevede l’impiego di farmaci in grado di attraversare la barriera emato-encefalica, quali Melarsoprol, Eflornitina e Nifurtimox. Questi farmaci sono in uso da molto tempo, nonostante presentino elevata tossicità ed effetti collaterali anche mortali (1-5% dei casi).
Melarsoprol
(Aventis): Possiede un gruppo arsenossido schermato ed èliposolubile. Per questa ragione dovrebbe raggiungere facilmente il SNC ma, inaspettatamente, in questa sede si trovano bassi livelli del farmaco. Melarsoprol, somministrato per via intravenosa, entra nel parassita
grazie al trasportatore purinico P2 ed è in grado di inibire molte importanti funzioni metaboliche e di trasporto. Parassiti esposti al farmaco lisano rapidamente, poiché il composto è in grado di interagire con i tioli tra cui il tripanotione, tiolo a basso peso molecolare presente nei tripanosomatidi [Vanschaftingen et al., 1987]. Nei pazienti il farmaco è convertito in ossido di melarsen che, mediante il trasportatore P2, penetra nel parassita e reagisce con il tripanotione formando l’addotto, reversibile ma stabile, MelT, inibitore competitivo della tripanotione riduttasi (TR), indispensabile nel mantenere il corretto equilibrio redox-tiolico intracellulare [Fairlamb and Cerami, 1992]. Nonostante il farmaco sia molto tossico resta tra i più usati per il trattamento delle fasi avanzate della malattia. Effetti collaterali comuni del Melarsoprol sono vomito, coliche addominali, neuropatie periferiche, tromboflebiti e, in pazienti con deficienza di G6PD, emolisi acute. Nel 5-10% dei casi sono state riscontrate gravi encefalopatie, con una media di decessi pari al 50% [Pepin and Milord, 1994; Blum et al., 2001]
Eflornitina
(Aventis): sintetizzata negli anni ’70 come farmaco antitumorale fu casualmente sperimentata da un parassitologo in modelli animali di tripanosomiasi africana, ottenendo risultati così incoraggianti da portare rapidamentealla sperimentazione clinica. Studi più rigorosi, impostati dal 1985 dall’OMS in collaborazione con la ditta produttrice, la Merrel Dow Pharmaceuticals e le autorità sanitarie di paesi africani, dimostrarono che l’eflornitina era in grado di produrre
risultati clamorosi in alcuni casi di pazienti in coma affetti da tripanosomiasi, tanto che fu soprannominata “il farmaco della resurrezione” e venne impiegato nella cura delle fasi avanzate di infezioni da T. b. gambiense. Eflornitina o D,L-α-difluorometilornitina (DFMO) è un analogo dell’amminoacido ornitina e agisce come inibitore dell’ornitina decarbossilasi del tripanosoma (ODC), enzima coinvolto nella biosintesi delle poliammine (putrescina, spermina, spermidina) importanti nella crescita, differenziazione e replicazione cellulare [Bacchi et al., 1980; Phillips et al., 1987; Bacchi and Yarlett, 1993. La somministrazione del farmaco è correlata anche ad una riduzione della sintesi di DNA, RNA e proteine e ad una serie di variazioni morfologiche e biochimiche che fanno sì che il parassita non sia in grado di dividersi [Fairlamb et al., 2003; Nishimura et al., 2006]. Sia l’Eflornitina che il Melarsoprol riducono i livelli intracellulari del tripanotione inibendo rispettivamente la sua biosintesi e la sua diffusione
Nifurtimox
(Bayer): composto nitroeterociclico a basso costo e somministrabile per via orale, usato inizialmente per la cura del mal di Chagas. Il farmaco ha un nitro-gruppo essenziale per la sua attività. La riduzione di un elettrone delnitro-gruppo genera un radicale libero, che può interagire con costituenti cellulari o metaboliti ridotti dell’ossigeno, altamente tossici come anioni superossido (O2-),
perossido d’idrogeno (H2O2), radicali (RS... e OH) e disolfuri (RSSR). Lo stress
ossidativo dovuto a questi cicli redox può danneggiare componenti cellulari come DNA, lipidi di membrana e proteine, determinando morte del parassita [Docampo and Moreno, 1986; Enanga et al., 2003] .
Attualmente per il trattamento della tripanosomiasi si seguono due differenti strategie. Da un lato si sta cercando di migliorare la situazione usando i farmaci esistenti. Si cerca quindi, di migliorare i risultati ottenibili con le medicine esistenti, ma si è consapevoli che ciò non è sufficiente. Altra via è data dalla ricerca: si prova a selezionare nuove molecole, per trovare una terapia completamente nuova [Kremsner and Krishna, 2004].
4 PROSPETTIVE FUTURE PER LA CHEMIOTERAPIA
Il farmaco ideale per il trattamento di infezioni parassitarie dovrebbe essere efficace sia in fase acuta che cronica della malattia, accessibile al paziente, non richiedere il ricovero, non indurre resistenza nel parassita, essere privo di effetti collaterali ed essere efficace dopo pochi trattamenti [Coura e De Castro, 2002].
Da circa 30 anni, la maggior parte delle ricerche per la sconfitta della tripanosomiasi sono incentrate su aspetti molecolari e biochimici del tripanosoma. I tripanosomi si prestano bene ad essere studiati, sono facilmente mantenuti in coltura e si dividono rapidamente. Sono stati creati diversi modelli di tripanosoma usati per la ricerca in parassitologia e immunologia molecolare. Nel 2005, con la pubblicazione del sequenziamento genomico del tripanosoma, sono aumentate le conoscenze relative alla sua biochimica. Bersaglio dei nuovi farmaci potrebbero essere le vie biochimiche presenti in tripanosoma e assenti nell’organismo ospite [Wang, 1995; Berriman et al., 2005]. Diverse tecniche (RNA interference, gene distruption) sono per questo utilizzate al fine di scoprire enzimi e pathways metabolici indispensabili per il parassita [Wang et al., 2000; Heby et al., 2003; Montalvetti et al., 2003].
4.1 Dal genoma del parassita al farmaco
Il percorso che porta alla sintesi di un nuovo terapico è lungo e complesso (Fig.3). La scoperta e lo sviluppo di un nuovo farmaco richiede diverse fasi:
- Individuazione del bersaglio e sua convalida: è necessario individuare gene o geni bersaglio, unici e essenziali (filtro biologico). I bersagli sono saggiati in diverse librerie chimiche per poter individuare gli inibitori (filtro chimico); - Formulazione ed ottimizzazione: dopo una selezione, le molecole scelte sono
modificate per aumentare l’efficacia contro il parassita, per poi identificare le molecole candidate con appropriate caratteristiche del farmaco-ideale.
- Test per la sicurezza e efficacia del farmaco (filtro clinico; si svolge a sua volta in tre fasi)
Queste fasi descrivono in maniera semplicistica il processo che porta all’identificazione di nuovi terapici; in realtà il percorso presenta diversi ostacoli e costa molto in tempo e denaro [Fairlamb, 2003].
4.2 Dal farmaco al parassita: possibili bersagli
Pathways biochimici presenti nel tripanosoma ma assenti nei mammiferi ospiti sono potenziali targets per i nuovi terapici. Come già detto, RNAi e manipolazioni genetiche (Knock-out) sono state applicate in T.brucei e T. cruzi al fine di individuare inibitori specifici del metabolismo del parassita e i suoi trasportatori. I nuovi terapici, che verranno progettati, potrebbero seguire due percorsi d’azione differenti; o agire su trasportatori specifici del parassita o avere come bersaglio punti chiave del suo metabolismo.
1 Inibitori specifici del metabolismo del parassita
Fig. 3(a) Rappresentazione schematica delle diverse tappe del processo di sviluppo di nuovi farmaci. (b) Possibili lacune e ostacoli incontrati durante il processo di individuazione di un nuovo farmaco [da Fairlamb 2003].
Geni Bersagli Filtro biologico Filtro chimico Filtro clinico Farmaci candidati Farmaco Lacune e Ostacoli:
Gene con funzione sconosciuta Mancanza di strumentazioni per la convalida del
bersaglio
I bersagli non entrano a far parte della fase di scoperta
L’industria farmaceutica perde incentivi finanziari per lo screening
Le università perdono l’accessso a librerie chimiche
I farmaci candidati non rientrano in esperimenti clinici
Strategie industriali Perdita di risorse finanziarie Mancanza di volontà politica
Il farmaco non arriva al paziente
- Metabolismo dei tioli: Il ruolo svolto generalmente dal glutatione negli eucarioti, nei tripanosomi è svolto dal tripanotione (N1,N8-bis-glutationilspermidina), unico tiolo a basso peso molecolare. Tripanotione reduttasi (TR) è un enzima chiave del meccanismo di difesa anti-ossidante del parassita, assente nelle cellule ospiti di mammifero. La differenza maggiore tra TR e glutatione reduttasi (GR, presente in cellule di mammifero) è la specificità nei confronti del proprio substrato, rispettivamente tripanotione e glutatione [Cerecetto et al., 2000]. TR, così come il suo substrato, è essenziale per la sopravvivenza e virulenza del parassita. Tutti gli enzimi coinvolti nel metabolismo del tripanotione, e in particolare TR, sono dei buoni bersagli di nuovi terapici [Fairlamb and Cerami; 1992].
- Pathway del pentoso fosfato: Diversi enzimi di tripanosoma coinvolti in questo e altri pathways sono più simili a isoforme presenti nei cianobatteri anziché ad enzimi di eucarioti. [Hannaert et al., 2003]. Il terzo enzima implicato in questa via metabolica, la 6-fosfogluconato deidrogenasi (6PDGH), è essenziale in tripanosoma, e le differenze strutturali sono sufficienti per creare inibitori specifici. In questa via metabolica, è prodotto NADPH il quale svolge una serie di funzioni tra cui protezione del parassita dallo stress ossidativo. La 6PDGH è essenziale per la crescita della forma infettiva (tripomastigote) di T.cruzi [Barrett et Gilbert, 2002]. L’inibizione della 6PDGH determina l’eliminazione del parassita.. Tre serie di analoghi del 6PG sono stati saggiati sia per la capacità di inibire la 6PDGH sia per la tossicità contro la forma tripomastigote e quella amastigote (forma replicativa) di T. cruzi. I risultati ottenuti indicano che alcuni composti hanno attività contro il tripanosoma anche se non ci sono evidenze della sua correlazione con l’inibizione enzimatica [Barrett et Gilbert, 2002].
- Metabolismo delle poliammine: Unico farmaco per il quale è noto il meccanismo d’azione nella tripanosomiasi africana è l’Eflornitina, inibitore suicida dell’ornitina decarbossilasi (ODC), il primo enzima di questo pathway. Il turnover di ODC, in T. b.
gambiense, è più lento rispetto alla forma analoga presente nei mammiferi, così, il
parassita, dopo la somministrazione di Eflornitina, non è in grado di sintetizzare poliammine per periodi prolungati. Il farmaco è attivo nei confronti dell’infezione causata da T. b. gambiense ma non in quella causata da T. b. rhodesiense. Questo perché
sprovvisto di ODC e, di conseguenza, risulta refrattario agli effetti dell’Eflornitina [Bacchi et al., 1980; Muller et al., 2001].
- Metabolismo degli steroli: La biosintesi degli steroli nei tripanosomi è molto simile a quella che avviene nei funghi, piuttosto che nelle cellule di mammifero [Urbina, 2001;]. - Degradazione delle proteine: La cruzaina è la più importante cisteina proteasi di
T.cruzi. Studi dimostrano che l’enzima è indispensabile per la sopravvivenza e crescita
del parassita e per questo la cisteina proteasi risulta un importante bersaglio [Du et al. 2002]. Inibitori della proteasi arrestano la proliferazione del parassita e inducono, con una minima tossicità, guarigione in modelli murini affetti da forma acuta e cronica del mal di Chagas [Du et al. 2002]. Nei tripanosomi si riscontra un certo turnover di proteine associate al proteasoma [Stevens et al., 1999; Barrett et al.,2003]: in effetti, inibitori del proteasoma quali la lactacistina sono tossici per il parassita.
Inibitori di trasportatori specifici del parassita
La membrana plasmatica del parassita rappresenta l’interfaccia tra il parassita e l’ospite. Per definizione, il parassita assume nutrienti dall’ospite, per cui i trasportatori trans-membrana, indispensabili per la sua sopravvivenza, rappresentano un buon bersaglio chemioterapico. Trasportatori specifici associati alla membrana plasmatica possono essere sfruttati nel veicolare farmaci diretti contro il parassita [Barrett et al., 2003]. Altri bersagli chemioterapici sono dati da diverse componenti cellulari come componenti della parete cellulare o sistemi di trasporto di membrana. L’instaurarsi di forze non covalenti (interazioni elettrostatiche), legami idrogeno e interazioni idrofobiche tra bersaglio e farmaco per una stretta interazione recettore-ligando fa sì che non siano necessari legami covalenti [Barrett and Fairlamb, 1999].
- Architettura di membrana: Molte delle più importanti proteine strutturali di superficie del tripanosoma sono attaccate mediante ancore glicosilfosfatidilinisotoliche (GPI). Poiché il miristato, è necessario nel rimodellamento delle ancore GPI, l’inibizione della sua biosintesi rappresenta un possibile target. [Barrett et al., 2003].
- Aquaporine: Il genoma di T. brucei codifica per tre aquagliceroporine, che sono state recentemente clonate e caratterizzate da Uzcategui et al. [2004]. Questo studio valuta
prende in considerazione la loro capacità di trasportare metalloidi. Resta dubbio il fatto che tali aquagliceroporine siano in grado di mediare l’assorbimento di arsenico in forma di Melarsoprol o di ossido di melarsene, poiché queste molecole sono troppo grandi per le ridotte dimensioni del poro associato alle aquagliceroproteine [Beitz, 2005].
-Trasportatore tiaminico: La tiamina presenta un parziale motivo di riconoscimento per il trasportatore P2 [Stoffel et al., 2006] e inibisce, in maniera competitiva, il trasporto di adenosina mediato da P2 [Delespaux & de Koning, 2007]. Tuttavia, non è stato riscontrato un accumulo significativo di tiamina nelle forme di T. b. brucei con ciò si può concludere che ossido di melarsene non entra in tripanosoma attraverso il trasportatore tiaminico [Delespaux e De Koning, 2007].
- Trasportatore P2: E’ un trasportatore ammino-purinico, codificato dal gene TbAT1. Il P2 riconosce l’adenina e l’adenosina come substrati, ma può anche trasportare altri tipi di molecole quali derivati melaminici (triazine), come il melarsoprol e derivati benzamidinici come la pentamidina [Carter e Fairlamb, 1993; Barrett e Fairlamb, 1999; de Koning e Jarvis, 1999].
4.3 Ricerca e sviluppo di nuove molecole
Il mio lavoro di tesi s’inserisce in un progetto di lavoro più ampio nell’ambito di ricerche per nuovi ed efficaci terapici per la Tripanosomiasi africana.
Dal 2003, Medici Senza Frontiere ha dato vita ad una specifica organizzazione per affrontare il problema delle malattie dimenticate. DNDi (Drugs for Neglected Diseases iniziative) ha come scopo principale quello di elaborare/finanziare progetti per la definizione di cure di malattie che affliggono essenzialmente i paesi più poveri del mondo con particolare riguardo a quelle derivanti da infezioni da parassiti. Obiettivo è arrivare alla produzione di rimedi efficaci il cui accesso per i pazienti non sia subordinato alle regole del profitto e della speculazione.
Per debellare la malattia, l’attenzione è stata focalizzata sullo studio di trasportatori specifici del parassita ma non presenti nell’organismo ospite, in modo da avere specificità di bersaglio. Ottimo target risulta essere il trasportatore purinico P2 di T.
brucei, il quale, oltre ad adenosina e adenina, riconosce come suoi substrati derivati
benzamidinici e derivati melaminici. Attualmente l’attenzione è focalizzata sulla progettazione e sintesi di nuovi composti nitroeterociclo-melaminici. E’ risaputo che composti nitroeterociclici hanno alta attività tripanocida, ma risultano tossici per l’organismo ospite. Associando l’anello nitroaromatico a melamina, si dovrebbe incrementare la specificità d’azione del farmaco in T. brucei e ridurre la tossicità nell’ospite. I composti nitroeterociclici associati a melanina ad oggi sintetizzati sono derivati da un composto leader (Fig. 4) costituito da una porzione melaminica legata ad un 5-nitrofurano. Sostituzioni nei gruppi amminici (1), dell’ossigeno furanico (2) e del nitrogruppo (3) hanno originato una serie di composti.
Fig. 4 Composto leader
1 2
3
Buoni terapici sono definiti quelli che sono contemporaneamente efficaci sul parassita e privi di effetti sull’ospite. A tale scopo, nel mio laboratorio si è proceduto a valutare gli effetti citotossici e genotossici dei composti di nuova sintesi.
In particolare, i composti neo-sintetizzati sono stati saggiati per l’induzione di:
effetti citotossici;
effetti mutageni in batteri;
danno al DNA in cellule umane, rilevato tramite il Comet assay;
danno citogenetico in cellule umane tramite il test dei Micronuclei.
Come precedentemente illustrato, la valutazione della relazione tra struttura e attività è di fondamentale importanza nella progettazione di nuovi composti. In tale contesto si pone il mio lavoro di tesi. L’induzione di mutanti da parte dei nuovi composti rilevata in ceppi di Salmonella typhimurium con diverse caratteristiche ha permesso di valutare l’attività di questi composti in relazione allo loro struttura. I dati, insieme a tutti gli altri ottenuti, saranno successivamente immessi in modelli SAR, utili nella progettazione di nuovi terapici.
4.3.1. Comet test
Negli ultimi anni la versione alcalina del test della cometa (Single Cell Gel Electrophoresis Assay, SCGE assay), introdotta da Singht et al (1988) è diventata uno strumento nuovo nella tossicologia genetica utile a valutare sia in vitro che in vivo il danno genotossico indotto da una serie di agenti fisici o chimici. Le peculiari caratteristiche di tale procedura hanno reso il test un utile strumento di indagine in differenti campi (genotossicologia, clinica, biomonitoraggio ambientale e umano). Il Comet assay si è dimostrato essere un metodo sensibile, rapido ed economico per valutare il danno al DNA in una svariata tipologia di cellule.
Il Comet assay è una tecnica visiva a fluorescenza molto semplice che valuta l’integrità del DNA misurando il danno in relazione alla presenza, dopo elettroforesi, di DNA frammentato all’esterno del core del nucleo [Singh et al., 1988]. I frammenti rilassati e/o rotti del DNA, carichi negativamente, migrano verso l’anodo e l’immagine che ne risulta ha l’aspetto di una cometa. La quantità di DNA migrato dalla “testa” della cometa è indice dell’entità del danno subito. La lunghezza della coda inizialmente aumenta con il danno, raggiungendo poi un massimo definito in larga misura dalle condizioni elettroforetiche e non dalle dimensioni dei frammenti.
Il Comet assay viene generalmente effettuato a pH > 13 e permette di rilevare, oltre alle rotture a singolo e doppio filamento, i cosiddetti siti “alcalo-labili”, siti resi suscettibili di rottura a valori elevati di pH a causa di distorsioni del filamento di DNA provocate da vari tipi di modificazioni (addotti, siti apurinici e apirimidinici, ossidazioni delle basi azotate, etc.) [Isabelle et al., 1995]. Il pH alcalino è necessario anche per un’efficiente denaturazione delle molecole di DNA che sono così in grado di migrare liberamente all’interno del campo elettrico [Singh et al., 1988].
4.3.2. Test dei micronuclei
L’analisi citogenetica è un metodo accurato per l’identificazione del danno al DNA indotto a livello cromosomico. Tale studio costituisce una parte essenziale della tossicologia genetica perché la mutazione cromosomica è un importante evento nel processo di cancerogenesi [Fenech, 2000].
Il test dei micronuclei, introdotto nel 1976 da Countryman e Heddle, è un test per misurare la capacità di agenti chimici o fisici di indurre danno cromosomico; è in grado
evidenziando rotture, perdite e riarrangiamenti di materiale cromosomico, inibizione del ciclo cellulare, necrosi e apoptosi cellulare.
I micronuclei si originano da frammenti acentrici che non segregano correttamente durante la divisione cellulare o dal ritardo nella migrazione anafasica di interi cromosomi. Alla telofase tali porzioni di materiale cromosomico gradualmente si decondensano originando nuclei accessori al nucleo principale, morfologicamente più piccoli definiti micronuclei. Il calcolo del numero di cellule mononucleate, binucleate o multinucleate permette, inoltre, di stimare l’indice di divisione cellulare e misurare in tal modo il grado di tossicità a seguito del trattamento.
4.3.3. Test di reversione in Salmonella typhimurium
È un test di mutagenesi a breve termine impiegato per effettuare lo screening di agenti chimici potenzialmente mutageni. Tale metodica [Maron e Ames, 1983] è in grado di rilevare la mutazione genica in organismi modello batterici, opportunamente modificati, basandosi sul sistema della reversione della mutazione. In questo tipo di test la mutazione genica viene rilevata in base al ripristino della funzione originaria di un gene mutato e inattivo a seguito del verificarsi di un secondo evento mutazionale. Per l’applicazione del test si utilizzano come organismi modello ceppi di Salmonella
typhimurium mutati in uno dei geni che costituiscono l’operone per la biosintesi
dell’Istidina. L’assenza di una fonte esterna di Istidina impedisce la crescita batterica e la formazione della colonia su piastra di terreno minimo. La crescita delle colonie si osserva esclusivamente a seguito del verificarsi della reversione della mutazione che comporta per la cellula il ripristino della capacità di sintesi dell’amminoacido in questione. I revertenti si identificano come colonie in grado di crescere in terreno minimo con concentrazione minima di Istidina che funge da innesco alla crescita batterica. Esiste un livello di reversione spontanea caratteristico di ciascun ceppo che rimane relativamente costante; il trattamento con un agente mutageno comporta un aumento della frequenza spontanea di reversione batterica propria di ciascun ceppo. I ceppi generalmente utilizzati sono TA98, TA100, TA1535, TA1538 e TA102. Questi ceppi batterici derivano da una serie di manipolazioni genetiche necessarie per aumentare la sensibilità all’azione dei mutageni. Di seguito sono riportate le caratteristiche dei ceppi utilizzati in questo studio:
Ceppo Gene riparazione LPS Richiesta Plasmide Tipo di mutazione
Mutato DNA Biotina
TA98 hisD uvrB rfa bio- pKM101 frameshift
TA100 hisG uvrB rfa bio- pKM101 sostituzione di base
TA1535 hisG uvrB rfa bio- - sostituzione di base
La mutazione rfa comporta una parziale perdita del lipopolisaccaride di parete che rende la cellula permeabile anche a sostanze particolarmente ingombranti. La mutazione uvrB determina delezione del gene che codifica per il sistema di riparazione del DNA mediante escissione (nella delezione di uvrB è stato deleto congiuntamente anche il gene bio codificante per la biosintesi della Biotina). Infine la presenza del plasmide pKM101 codifica per un sistema di riparazione “error prone” e conferisce resistenza all’Ampicillina.
Dal punto di vista fenotipico sono ceppi Istidina e Biotina dipendenti; sensibili al Cristalvioletto, sensibili agli UV e Ampicillina resistenti (TA98 e TA100).
Composti con un nitrogruppo attaccato ad una porzione aromatica o eteroaromatica sono generalmente sostanze biologicamente attive. In particolare, molti composti nitroaromatici sono in grado di creare legami covalenti con il DNA. La forma reattiva di questi composti si origina da una nitroriduzione particolarmente attiva nelle cellule batteriche. La mutagenicità di questi composti può essere saggiata più in specifico utilizzando ceppi batterici opportunamente modificati per essere maggiormente resistenti ai nitroderivati perché mancano dell’attività nitroreduttasica come il ceppo TA98NR e TA100NR.
5 Analisi dei composti
Nitrofuraldeide (NFA)
Questo composto costituisce la porzione nitrofuranica alla base dei composti analizzati.
NFA induce un forte incremento di mutanti nel ceppo TA100 già a 5µg/piastra. L’andamento a “campana” che si osserva è indice di tossicità: l’induzione di revertenti è “mascherata” dalla mortalità, cioè, diminuendo il numero di batteri della popolazione iniziale (≈ 108
batteri/piastra) anche il numero di mutanti rilevabili diminuisce nonostante l’agente in esame sia un potente inducente.
Tale analisi è confermata dai dati ottenuti in presenza di S9. In questo caso si osserva un maggior numero di revertenti rispetto al test condotto in assenza di S9. In effetti, ciò è dovuta non all’attivazione metabolica di NFA (da promutageno a mutageno) ma ad una detossificazione dell’attività citotossica del composto.
La mancata nitroriduzione di NFA (TA100NR) porta a risultati apparentemente simili a quelli osservati in presenza di S9. C’è da osservare che, confrontando TA100+S9 e TA100NR, vale a dire mortalità cellulare relativamente più bassa, nel ceppo nitroreduttasi deficiente si rileva, a parità di dose, un minor numero di revertenti rispetto al ceppo proficiente. Questi dati indicano che almeno parte dell’attività mutagena di NFA è legata al meccanismo di nitroriduzione.
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/p1astra) R e v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
WSP746
Questo composto costituisce la parte melaminica delle molecole in esame
La melamina non appare in grado di indurre alcun effetto nei ceppi di Salmonella saggiati.
WSP934
È’ questa la molecola leader composta da una porzione nitrofuranica e da una porzione melaminica
WSP934 induce revertenti in TA100 già a partire dalla dose più bassa utilizzata (5µg/piastra). Per dosi >20µg/piastra si osserva un declino del numero di mutanti legato ad un’aumentata mortalità nella popolazione. La molecola in esame è detossificata da S9 con una conseguente minor produzione di revertenti e una più bassa mortalità.
In TA100NR si rileva un maggior numero di revertenti rispetto al ceppo TA100 sia con che senza S9, con un plateau raggiunto a 40µg/piastra. Anche in mancanza di nitroriduzione il composto risulta essere un forte mutageno in Salmonella. È d’altra parte vero che l’assenza di nitroriduttasi comporta una maggior vitalità nella popolazione batterica,
Nel ceppo 1535 si osserva un incremento dose-dipendente del numero di revertenti,
TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 250 500 750 1000 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 250 500 750 1000 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA1535 0 50 100 150 0 250 500 750 1000 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
L’insieme di questi dati suggerisce che, come riportato per molti composti nitroeterociclici [Mc Calla et al., 1983], WSP934 è almeno parzialmente detossificato da S9. Inoltre, la nitroriduzione sicuramente comporta un aumento della mortalità cellulare. L’induzione di mutazioni appare invece poco legata a tale processo.
Il confronto tra i ceppi frameshift (TA98 e TA98NR) e quelli per sostituzione di base (TA100 e TA100NR) puntualizza che il meccanismo più attivo di mutazione di WSP934 è quello per sostituzione di base. Tale osservazione è indipendente dalla minor frequenza spontanea di mutazione presente nei ceppi frameshift (≈10 volte più bassa) rispetto ai TA100. Infatti, confrontando di quanto aumentano relativamente al proprio controllo negativo, si osserva che nei ceppi frameshift l’incremento indotto da WSP934 è 3-5 volte mentre negli altri si arriva a 10-12 volte.
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 50 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA98 0 50 100 150 200 250 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA98NR 0 50 100 150 200 250 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
WSP939
Questo composto è un derivato di WSP934 privo del nitrogruppo.
Non si rilevano effetti significativi indotti dal composto fino alla dose 1mg/piastra che risulta tossica per Salmonella.
La mancanza di mutagenicità in WSP939 sembra essenzialmente legata alla mancanza del nitrogruppo dell’anello furanico.
WSP1342
Il composto è fortemente mutageno in Salmonella. In TA100 si osserva una risposta dose-dipendente fino a 20µg/piastra con un successivo decremento del numero di revertenti ed infine una sopravvivenza uguale a zero alla dose più alta.
La metabolizzazione da parte di S9 della molecola comporta una significativa riduzione dell’effetto.
La nitroriduzione del composto ne aumenta mutagenicità e tossicità anche se nel ceppo nitroreduttasi deficiente viene indotto un numero cospicuo di mutanti.
I dati relativi al ceppo TA1535 confermano la capacità detossificante di S9 nei confronti di WSP1342. TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 250 500 750 1000 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 250 500 750 1000 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
WSP1343
La frequenza di reversione in TA100 è fortemente incrementata già alla dose più bassa. Alle dosi successive, l’alta mortalità nella popolazione batterica porta ad una diminuzione del numero rilevabile di mutanti.
In presenza di S9, anche se il numero di revertenti aumenta in relazione alla dose, si osserva una netta diminuzione del potenziale geno-citotossico del composto.
La curva relativa al TA100NR ha un andamento simile a quello osservato per TA100 anche se con una “traslazione” verso le dosi più alte. Ciò indica che WSP1343 agisce anche con un meccanismo svincolato dalla nitroriduzione.
La capacità detossificante di S9 nei confronti di questo composto è confermata dai dati relativi al ceppo TA1535.
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rte n t i - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
WSP1344
Il composto è fortemente mutageno in Salmonella. In TA100 si osserva una risposta dose-dipendente fino a 20µg/piastra con un successivo decremento del numero di revertenti ed infine una sopravvivenza uguale a zero alla dose più alta.
La metabolizzazione da parte di S9 della molecola comporta una significativa riduzione dell’effetto.
La nitroriduzione del composto ne aumenta mutagenicità e tossicità. Nel ceppo nitroreduttasi deficiente, che mostra un andamento simile a quello trovato in TA100 (in TA100NR la tossicità inizia a manifestarsi per dosi >40µg/piastra), viene ancora indotto un numero cospicuo di mutanti.
I dati relativi al ceppo TA1535 confermano la capacità detossificante di S9 nei confronti di WSP1344. TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9
WSP1367
Il meccanismo di induzione di mutanti in Salmonella da parte di WSP1367 risulta indipendente dalla riduzione del nitrogruppo. La metabolizzazione del composto da parte del complesso del citocromo P450 ne riduce la mutagenicità come evidenziato sia in TA100 sia in TA1535.
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
WSP1364
La mutagenicità di WSP1364 è molto debole. In TA100 si osserva un raddoppio del numero di revertenti spontanei solo per dosi ≥ 80µg/piastra; tale lieve incremento viene ad essere annullato sia in presenza di S9 sia in assenza di
nitroriduzione. Non si osservano effetti
significativi in TA1535. TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA100 500 1000 1500 2000 2500 3000 R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 500 1000 1500 2000 2500 3000 R e v e rt e n ti - S9
WSP1365
La capacità di WSP1365 di indurre mutagenicità è molto bassa. In TA100 si osserva un raddoppio del numero di revertenti spontanei solo per dosi ≥ 80µg/piastra; tale lieve incremento viene ad essere annullato in assenza di nitroriduzione.
Non si osservano effetti significativi in TA1535.
WSP1368
Si rileva un chiara curva dose-effetto in TA100 (minima dose efficace, MDE: 5µg/piastra) la cui pendenza viene drasticamente ridotta dalla presenza di S9 (MDE:
40µg/piastra), e, anche se in misura minore, dall’assenza di nitroreduttasi (MDE: 20µg/piastra).
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 50 100 150 200 250 300 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 50 100 150 200 250 300 Dose (µg/piastra) re v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 50 100 150 200 250 300 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 R e v e rt e n ti - S9
WSP1369
La presenza di S9 riduce fortemente l’efficacia del composto in TA100 (riduzione del numero di revertenti di circa il 75%; MDE: 10µg/piastra invece di 5µg/piastra).
Un forte calo dell’induzione di revertenti si osserva anche nel ceppo TA100NR (riduzione del numero di revertenti di circa il 75%; MDE: 10µg/piastra invece di 5µg/piastra). Ciò indica l’importanza del processo di nitroriduzione nel determinare l’efficacia del composto.
Anche nel ceppo TA1535 si osserva la detossificazione del composto ad opera di S9.
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/pIastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
WSP1370
Il composto risulta fortemente mutageno in TA100. La metabolizzazione ad opera di S9 riduce a circa la metà il numero di revertenti ed innalza la MDE (da 5 a 10µg/piastra). La nitroriduzione risulta pressoché necessaria per l’attivazione del composto (riduzione al 25% dei revertenti in TA100; MDE: 20µg/piastra).
I dati ottenuti nel ceppo TA1535 confermano quelli rilevati in TA100.
L’induzione di mutazioni frameshift (TA98) risulta praticamente trascurabile rispetto a quella per sostituzione di base.
TA100 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/plate) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA100NR 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/plate) R e v e rt e n ti - S9 TA1535 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9 TA98NR 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 TA98 0 50 100 150 0 20 40 60 80 100 Dose (µg/piastra) R e v e rt e n ti - S9 +S9
