Cinetica enzimatica

La cinetica enzimatica si occupa in modo particolare degli aspetti cinetici (cioè legati al fattore tempo) del legame enzima-substrato e della conseguente generazione di un prodotto. I dati di velocità utilizzati nelle analisi cinetiche sono ottenuti da saggi enzimatici. Nel 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten proposero una teoria quantitativa della cinetica enzimatica, che è tuttora nota come cinetica di Michaelis-Menten.^[12] Il loro lavoro è stato ulteriormente ampliato nel1925 da George Edward Briggs e John Burdon Sanderson Haldane, che hanno messo a punto le equazioni cinetiche utilizzate comunemente ancora oggi.^[13]

3.1.3.1 Cinetica di Michaelis-Menten

Il maggior contributo di Michaelis e Menten fu quello di suddividere idealmente l'azione degli enzimi in due fasi. Nella prima fase, il substrato si lega reversibilmente all'enzima, formando il complesso enzima-substrato (ES), a volte chiamato complesso di Michaelis-Menten in loro onore. La fase successiva è la vera e propria conversione del substrato a prodotto.

Gli enzimi sono in grado di catalizzare alcuni milioni di reazioni al secondo. Per esempio, la reazione catalizzata dalla orotidina-5-fosfato decarbossilasi impiega circa 25 millisecondi per processare la stessa quantità di substrato che, in assenza dell'enzima, verrebbe convertita in 78 milioni di anni.^[14]

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La velocità enzimatica dipende dalle condizioni della soluzione e dalla concentrazione del substrato. Condizioni denaturanti, come le alte temperature, pH lontani dalla neutralità o alte concentrazioni saline riducono l'attività enzimatica. Alte concentrazioni di substrato, invece, tendono ad incrementare l'attività.

La velocità massima di una reazione enzimatica è individuabile incrementando la concentrazione di substrato fino a raggiungere un livello a cui la velocità stessa rimane costante (nella curva di saturazione, è il livello indicato in alto a destra). La saturazione ha luogo perché, all'aumentare della concentrazione di substrato, una quantità sempre maggiore di enzima libero è convertita nella forma ES. Alla velocità massima (definita Vmax) dell'enzima, tutti i siti attivi dell'enzima sono saturi di substrato, e l'ammontare del complesso ES è pari a quello dell'enzima stesso.

La Vmax è solo una delle costanti cinetiche che caratterizzano gli enzimi. Un'altra molto usata fornisce informazioni sulla quantità di substrato necessaria per raggiungere una determinata velocità di reazione. Si tratta della costante di Michaelis-Menten (abbreviata comunemente come Km), definita come la concentrazione di substrato necessaria per raggiungere la metà della Vmax. Ogni enzima presenta una Km caratteristica relativamente ad ogni diverso substrato.

Figura 3.9: Diagramma della velocità di reazione in relazione alla concentrazione del substrato ed indicazione del significato dei parametri

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Altra costante molto utilizzata è la kcat (o numero di turnover), definita come il numero di molecole di substrato convertite per secondo.

L'efficienza dell'enzima può essere espressa come rapporto tra kcat e Km. Tale rapporto è anche definito costante di specificità. Dal momento che tale costante incorpora sia l'affinità che l'abilità catalitica, spesso si utilizza per confrontare l'efficienza di diversi enzimi o quella di un unico enzima con differenti substrati. Il massimo teoretico per la costante di specificità è chiamato limite di diffusione ed è compreso tra 10⁸ e 10⁹ M⁻¹ s⁻¹. In questo intervallo, ogni collisione tra enzima e substrato ha come effetto la produzione di un prodotto, e la velocità di formazione del prodotto non è limitata dalla velocità di reazione ma dal limite di diffusione. Enzimi che presentano una tale proprietà sono detti enzimi cataliticamente perfetti o cineticamente perfetti.

La cinetica di Michaelis Menten si basa sulle costanti di velocità di reazione .

Queste sono relative ai processi illustrati nella schema seguente:

↔ ^(3.1)

ES è un intermedio di reazione il cui basso valore di energia permette di fare avvenire una specifica reazione, catalizzata da una specifica classe di enzimi, in modo molto favorevole (effetto catalitico). Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamico assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice che è stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).^[1]

In condizioni stazionarie (allo stato stazionario) la velocità di formazione del complesso enzima-substrato eguaglia la velocità di scomposizione:

( ) (3.2)

dove le parentesi quadre indicano la concentrazione molare.

La concentrazione totale dell'enzima, [E]0 è eguale alla somma della concentrazione dell'enzima legato con la concentrazione dell'enzima libero:

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Ricavando la concentrazione dell'enzima libero, [E], da questa relazione e sostituendola nella espressione cinetica dello stato stazionario, precedentemente descritta, si ricava:

( ) ( ) (3.3)

dalla quale, eseguendo i prodotti, è possibile ottenere la concentrazione del complesso enzima-substrato, [ES], in funzione delle concentrazioni di substrato ed enzima totale:

(3.4)

La velocità di formazione del prodotto è data dalla quantità di complesso enzima-substrato che si scompone nell'unità di tempo:

(3.5)

Dividendo numeratore e denominatore del rapporto, per il termine K₁, si ottiene la nota equazione di Michaelis-Menten:

(3.6)

dove K_M è la costante di Michaelis-Menten e rappresenta un termine che ingloba altri valori costanti. Inoltre, visto che una volta raggiunto lo stato stazionario il valore della velocità massima, V_max, è dato dal prodotto V_max = k₂ [E]₀ l'equazione di Michaelis-Menten può anche essere espressa nella forma alternativa:

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L'equazione di Michaelis e Menten mette quindi in relazione la velocità di formazione del prodotto V con la concentrazione del substrato [S].

La costante di Michaelis-Menten, KM, rappresenta la concentrazione di substrato necessaria affinché la reazione abbia velocità pari a metà della velocità massima. Essa equivale al seguente rapporto:

(3.8)

La costante di Michaelis-Menten è una grandezza caratteristica di ciascun enzima. Essa è un termine che indica quantitativamente l'affinità tra un enzima e il suo substrato: più basso è il valore di K_Me più bassa sarà la concentrazione di substrato che permette di raggiungere un valore di velocità di reazione pari alla metà della velocità massima, il che indica una alta affinità dell'enzima per il substrato. Viceversa un alto valore di KM indica che sarà necessario più substrato per raggiungere una velocità di reazione pari alla metà della velocità massima, il che significa una minore affinità dell'enzima per il substrato.

Riportando su un diagramma cartesiano l'andamento della velocità di reazione, dedotta secondo la cinetica di Michaelis-Menten, in funzione della concentrazione di substrato si ottiene graficamente un ramo di iperbole (figura 4.6). Risultano di ovvia deduzione le seguenti considerazioni:

 a basse concentrazioni di substrato la reazione è praticamente del primo ordine, crescendo la velocità proporzionalmente ad [S] (essendo l'enzima in forte eccesso rispetto al substrato, la sua concentrazione può considerarsi costante);

 ad alte concentrazioni di substrato la velocità tende ad assume un valore massimo che diviene costante. Ciò è dovuto alla completa saturazione dell'enzima che annulla l'effetto dovuto all'ulteriore aumento della concentrazione di substrato (non è presente più enzima disponibile). Una tale cinetica di reazione è di ordine zero e in questo caso risulta Vmax = K2 [E]⁰.

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Riportando l'equazione di Michaelis-Menten nella forma

(3.9)

è possibile ottenere il grafico dei doppi reciproci (o di Lineweaver-Burk), rappresentando graficamente l'andamento di 1/V in funzione di 1/[S]. In tal modo si ottiene una retta con intercetta sull'asse delle ascisse nel punto - 1/K_M, sull'asse delle ordinate nel punto 1/V_max e con coefficiente angolare pari al rapporto K_M/V_max.

3.1.3.2 Inibitori e cofattori

Gli inibitori enzimatici sono sostanze in grado di diminuire o annullare l'azione catalitica di un enzima. Possono agire legandosi al sito attivo competitivamente al substrato (inibizione competitiva) o legandosi ad un sito allosterico. L'inibizione può essere reversibile, rendendo possibile il ripristino della funzione catalitica dell'enzima tramite aumento della concentrazione del substrato rispetto all'inibitore; o irreversibile con l'impossibilità di potere ripristinare l'attività catalitica.

I meccanismi di inibizione esistenti sono:

 Inibizione reversibile: cartterizzata da molecole che si legano non covalentemente all'enzima motivo per cui dopo la loro rimozione l'enzima torna ad essere funzionante.

 Inibizione competitiva: viene occupato il sito di legame del substrato, impedendo al substrato di legarsi correttamente (formazione di un complesso EI al posto di uno ES). Se però si verifica prima il legame enzima-substrato, l'inibitore competitivo perde di efficacia. La consistenza dell'inibizione dipende dunque sia dalla concentrazione di inibitore che da quella di substrato. Spesso gli inibitori competitivi mimano in modo notevole la forma dei substrati di cui inibiscono il legame. All'aumentare della concentrazione di inibitore la kmapp aumenta la velocità della reazione. Asintoticamente però la velocità tende ancora a Vmax per cui l'effetto dell'inibitore può essere annullato aumentando la concentrazione di substrato.

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 Inibizione non competitiva: tali inibitori sono in grado di legare siti differenti dal sito attivo. Essi sono dunque in grado di legare sia l'enzima libero, sia in configurazione ES. Il loro legame all'enzima genera un cambiamento conformazionale dell'enzima stesso, che può avere come conseguenza l'inibizione del legame tra enzima e substrato. Non essendoci dunque competizione tra inibitore e substrato, l'importanza dell'inibizione dipende esclusivamente dalla concentrazione dell'inibitore stesso.

L'inibitore causa una diminuzione della Vmax ma non modifica la km.

 Inibizione acompetitiva: l’inibitore si lega a un sito diverso da quello del substrato, presente solamente nel complesso ES: interagisce solo con ES e non con E.

Figura 3.10: Schema di comparazione tra la reazione normale ed il meccanismo di inbizione competitiva.

Figura 3.8: Schema di comparazione tra la reazione normale ed il meccanismo di inbizione non competitiva.

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Vmax e km diminuiscono di uno stesso fattore all'aumentare della concentrazione di inibitore: Vmax/km è costante.

 Inibizione mista: In realtà non si verifica un'inibizione puramente non competitiva, ma un'inibizione di tipo misto in cui variano sia Vmax che km in modo diverso.

In pratica l'inibizione acompetitiva e l'inibizione mista avvengono solo negli enzimi con due o più substrati

 Inibizione irreversibile: svolta da inibitori in grado di reagire con l'enzima e formare un legame covalente. L'inattivazione così indotta è irreversibile. Esistono diversi composti di questo tipo: una classe importante è quella dei cosiddetti inibitori suicidi, che contano al loro interno la penicillina ed i suoi derivati. Gli antibiotici di questa classe vengono legati dal sito attivo dell'enzima bersaglio (le transpeptidasi) e vengono convertiti in un intermedio che reagisce in modo irreversibile con alcuni residui presenti nel sito attivo.

I cofattori invece sono delle sostanze che legandosi all’enzima in particolari siti consentono alla catalisi di avvenire correttamente o la velocizzano ulteriormente fungendo quindi da attivatori degli enzimi.