I citocromi P450 2C nel ratto

Tra le sottofamiglie di citocromo P450 presenti nel ratto la più importante è la sottofamiglia 2C, che costituisce da sola circa l'80% del contenuto totale di citocromo P450 epatico. Essa comprende almeno 8 diverse isoforme (CYP2C6, CYP2C7, CYP2C11, CYP2C12, CYP2C13, CYP2C22, CYP2C23 e CYP2C24), che sono prevalentemente coinvolte nel metabolismo endogeno di steroidi, retinoidi ed acido arachidonico, ma sono in grado di metabolizzare anche moltissimi xenobiotici.

Alcune di queste isoforme hanno la proprietà di essere sesso-specifiche, una caratteristica tipica dei P450 del ratto ma non dell'uomo. Il CYP2C12 è un isoenzima specificatamente femminile, mentre i CYP2C11 e CYP2C13 sono espressi soltanto in ratti maschi. Altri, come i CYP2C6 e CYP2C7, sono citocromi P450 prevalentemente femminili, ma sono presenti, a livelli più bassi, anche nei maschi (Agrawal and Shapiro, 2003).

Il CYP2C6 di ratto ha molte caratteristiche in comune con il CYP2C9 umano, poiché entrambi catalizzano la 4-idrossilazione del diclofenac e della fenitoina, e la 7-

reazioni catalizzate dal CYP2C6 sono la 7-N-demetilazione della caffeina, la O- deetilazione della 7-etossiresorufuna e l'1-idrossilazione del bufurarolo (Kot and Daniel, 2008; Kobayashi et al., 2002). Recenti esperimenti di immunoblotting su campioni di intestino di ratto, sia maschio che femmina, hanno evidenziato la presenza, a livelli relativamente bassi, del CYP2C6 in questo tessuto, sebbene con ampie variazioni interindividuali (Mitschke et al., 2008). Studi effettuati in vivo hanno, inoltre, dimostrato che il CYP2C6 è up-regolato (almeno a livello trascrizionale) in condizioni di ischemia- riperfusione, e che il conseguente aumento dell'attività epossigenasica potrebbe avere un ruolo nel danno miocardico da riperfusione. Al contrario, un'inibizione dell'attività epossigenasica potrebbe avere un ruolo protettivo contro il danno cardiaco post-ischemico (Ao et al., 2008). L'attività enzimatica del CYP2C6 è inibita dal β-naftoflavone (Kot and Daniel, 2007).

Il CYP2C7 è in grado di idrossilare il testosterone e l'acido retinoico, e prende parte al metabolismo della para-toluene-sulfonamide (PTS) (Zhou et al., 2006; Fan et al., 2004). Si tratta di un'isoforma costitutiva prevalentemente femminile che esibisce livelli di mRNA e proteina almeno doppi nelle femmine rispetto ai maschi. Da sola costituisce circa il 20% del contenuto totale epatico di P450 nelle femmine, e circa il 6% nei maschi (Agrawal and Shapiro, 2003).

Il CYP2C11 è in grado di metabolizzare molti substrati, tra i quali si ricordano il testosterone (2α-idrossilazione), la caffeina (demetilazione nelle posizioni 3-N e, soprattutto, 7-N), e l'anestetico locale bupivacaina (3'-idrossilazione) (Kot and Daniel, 2007, 2008; Saito et al., 2006). La sua attività è inibita dal β-naftoflavone e dal pregnenolone-16α-carbonitrile (Kot and Daniel, 2007).

Esperimenti di immunoblotting su campioni di intestino di ratto, sia maschio che femmina, non hanno rilevato la presenza del CYP2C11 in questo tessuto (Mitschke et al., 2008). Il CYP2C12 è un isoenzima esclusivamente femminile che costituisce circa il 40% del contenuto totale epatico di P450 nei ratti femmina, mentre risulta assente nei maschi di tutte le età (Agrawal and Shapiro, 2003).

Il gene codificante per il CYP2C13 occupa più di 50 kb ed esiste in due forme alleliche ben identificate (Eguchi et al., 1991).

Il CYP2C23 è coinvolto nella produzione di acidi epossieicosatrienoici (EET) dall'acido arachidonico, e presenta proprietà catalitiche simili ai CYP2C9 e CYP2C19 umani.

L'mRNA codificante per questa isoforma è stato riscontrato in vari organi di ratto, quali fegato, polmone, rene, milza, cuore, cervello e testicolo. Così come il CYP2C9 nell'uomo, il CYP2C23 è l'isoforma della sottofamiglia 2C maggiormente espressa nel rene, dove gli EET da essa prodotti contribuiscono a regolare la funzione renale agendo sui processi di trasporto tubulare e sul mantenimento del tono vascolare. In ratti ipertesi, l'espressione del CYP2C23 nei tubuli renali è diminuita, in concomitanza con la diminuzione della produzione di EET, confermando il suo importante ruolo nella funzione renale (Imaoka et al., 2005).

L'mRNA codificante per il CYP2C24 è stato inizialmente identificato da uno screening di cDNA di prostata di ratto; in seguito, però, esperimenti di Northern blotting hanno rilevato tale mRNA anche in campioni di fegato e rene. In ratti maturi questa isoforma è presente nei vari organi a livelli paragonabili nei due sessi, con l'eccezione del rene femminile, in cui non è espressa (Zaphiropoulos, 1991).

Numerosi studi hanno suggerito una relazione inversa tra l'età degli animali e l'attività catalitica di molti enzimi della superfamiglia del citocromo P450; in particolare è stato proposto che, mentre i livelli degli enzimi specificatamente maschili diminuiscono con l'avanzare dell'età, i livelli delle isoforme femminili rimangono costanti nelle femmine ed aumentano nel fegato dei maschi. Ad esempio il CYP2C11, isoforma specificatamente maschile diminuisce nei ratti maschi senescenti, mentre il CYP2C12, isoenzima prettamente femminile, risulta indotto negli stessi animali, indicando un processo di demascolinizzazione associato ad una femminilizzazione (Wauthier et al., 2007). Tuttavia, Agrawal and Shapiro (2003) hanno, invece, dimostrato che, con l'eccezione del CYP2C11, la cui espressione diminuisce sensibilmente (~70%) in ratti maschi senescenti, i livelli di CYP2C6, CYP2C7, CYP2C12 e CYP2C13 non si abbassano significativamente in ratti di età avanzata né maschi, né femmine. Inoltre l'età non ha effetto neanche sui livelli di induzione di queste isoforme da parte del fenobarbital.

La regolazione di questi citocromi P450 avviene prevalentemente a livello trascrizionale, ma poche informazioni sono disponibili sugli elementi regolatori importanti per la trascrizione, sia basale che indotta da ormoni o altri fattori regolanti l'espressione di questi geni (Ström et al., 1995). Nella regione regolatoria a monte del sito di inizio della

OTF-1 (Eguchi et al., 1991). I CYP2C7, CYP2C11, CYP2C12 e CYP2C13 sono regolati dall'ormone della crescita (GH) a livello trascrizionale, ma i rispettivi elementi regolatori non sono ancora stati identificati. Inoltre, studi hanno dimostrato che HNF-4 non è uno dei principali trans-attivatori per nessuna di queste isoforme (Ström et al., 1995).

Da un confronto fra umani e roditori, è emerso che il numero dei membri della sottofamiglia 2C è diverso, e che nessuna delle isoforme umane sembra avere un ortologo certo nei roditori, suggerendo che i dati riguardanti questi ultimi devono essere interpretati con cautela se estrapolati per gli umani (Uno et al., 2006).